Guanidină

Proteine membranare

Soluțiile de guanidină și SDS sunt solvenți denaturanți, dar am dorit, desigur, să caracterizăm și stările native ale proteinelor membranare. Dificultatea în acest caz a fost că nu exista încă un consens cu privire la modul în care să se definească sau să se conceapă starea nativă – ceea ce, pentru nou-veniții ca noi, se traducea prin incertitudine, deoarece nu aveam genul de experiență care să ne permită să ghicim cu chibzuință care dintre ideile aflate în dispută avea șanse să se dovedească a fi corectă.

Inclusiv bistratul fosfolipidic, singurul concept indispensabil pentru cea mai minimă înțelegere a membranelor celulare, era încă disputat, în ciuda faptului că fusese demonstrat pentru prima dată în globulele roșii cu aproape 50 de ani înainte și că era într-adevăr singurul aranjament imaginabil pe baza termodinamicii, o consecință directă a măsurătorilor clasice efectuate de Irving Langmuir în 1917 cu monostraturi de substanțe amfifile. Am descris acceptarea ridicol de lentă a conceptului de bistrat în perioada intermediară în cartea mea, Ben Franklin Stilled the Waves . Ceea ce vreau să spun aici este că scepticismul persista încă atunci când ne-am implicat în cercetarea membranelor.

Și printre cei care erau convinși de bistratul lipidic, modul de încorporare a proteinelor în membrane era încă deschis dezbaterii. Unii, cum ar fi colegul nostru de la Duke, David Robertson, erau reticenți în a crede că proteinele ar putea, de fapt, să pătrundă sau să traverseze un bistrat. Două imagini conceptuale destul de disparate, preluate de la o conferință de la Academia de Științe din New York în 1972, sunt prezentate în figura 3 . Una este „membrana unitară” a lui Robertson, cu proteinele în totalitate în exterior. Cealaltă prezintă viziunea lui Vanderkooi asupra complexelor de citocrom oxidază din membranele mitocondriale: proteina este poziționată mai realist, dar nu există încă nicio concepție despre domeniile hidrofile și hidrofobe distincte și despre modul în care acestea ar putea dicta interacțiunea proteină-lipid. Mai târziu, în același an 1972, imaginea idealizată, devenită convențională, a straturilor balistice fosfolipidice, cu proteine funcționale care le traversează în întregime, a devenit în cele din urmă popularizată de modelul „mozaicului fluid” al lui Singer și Nicolson .

Fig. 3. Două imagini conceptuale disparate ale proteinelor membranare, ambele propuse la aceeași întâlnire de la New York în 1972 : (a) Robertson credea că proteinele ar fi dispuse asimetric, în afara celor două suprafețe bistratificate; (b) vederea lui Vanderkooi a complexelor de citocrom oxidază în secțiune transversală.

În laborator au fost vremuri interesante, cele mai interesante de care îmi amintesc. Am învățat cum să folosim detergenți benigni, care, spre deosebire de SDS, puteau solubiliza proteinele membranare fără denaturare grosieră, într-un mediu care să simuleze starea nativă, dar un mediu în care acestea să fie, de asemenea, ușor accesibile pentru caracterizarea moleculară – un progres în care am fost în parte anticipați de doi tineri simpatici din Finlanda, Kai Simons și Ari Helenius .

În practică eram încă în mare parte limitați la măsurarea greutății moleculare și la a întreba câte lanțuri polipeptidice sunt pe moleculă, dar proteinele la care se adresau aceste întrebări fuseseră separate prin tratare cu detergent de alte componente ale membranei. Cel mai important, multe dintre proteine aveau o funcție celulară cunoscută, iar măsurătorile noastre erau relevante pentru aceste funcții. Am menționat deja celulele roșii din sânge, dar am reușit de fapt să acoperim o serie de subiecte relevante din punct de vedere biologic, impulsionați în multe cazuri de zelul misionar al studenților. De exemplu, un student absolvent de fiziologie, Stuart Grefrath, interesat de neurofiziologie, a venit în laboratorul nostru pentru a enumera lanțurile polipeptidice ale unei membrane excitabile – în acest caz, din nervul olfactiv al peștilor-gălbenele – și acest lucru ne-a condus la implicarea ulterioară în alte câteva sisteme de transport activ . (Stuart însuși a murit, din păcate, ca urmare a unei boli cardiovasculare congenitale înainte de a-și putea îndeplini promisiunea timpurie cu o carieră independentă). Mielina cerebrală a fost o altă membrană din sistemul nervos pe care am analizat-o.

De asemenea, merită evidențiați doi vizitatori ai laboratorului care au ales să lucreze împreună: Neal Robinson, un bursier postdoctoral, și Leon Visser, care era în concediu sabatic de la CSIR din Pretoria, Africa de Sud). Ei au făcut o treabă foarte bună în definirea cantitativă a structurii de domeniu a citocromului b5, un fel de prototip pentru a ilustra modul în care proteinele membranare sunt atașate de membrane și își îndeplinesc totuși funcția în citoplasma adiacentă .

În alte proiecte răspundeam la solicitări ale unor colegi îndepărtați. Am menționat deja lucrarea cu Arthur Karlin asupra receptorului de acetilcolină de la un pește electric. Un alt exemplu a fost bacteriorhodopsina, pentru care am făcut măsurători în soluție de detergent la cererea lui Walter Stoeckenius de la Universitatea din California . Aici a existat o întrebare importantă, legată de mecanismul activității de pompare a protonilor a acestei proteine: este proteina nativă un monomer funcțional sau (așa cum păreau să sugereze unele date) este un trimer? Proteina noastră solubilizată era fără îndoială un monomer și dovezile spectrale indicau că trecea prin același ciclu de modificări moleculare ca și în membrana nativă.

În cele mai multe cazuri noi înșine nu ne-am implicat direct în încercarea de a desluși cum funcționau receptorii, pompele sau canalele, dar am devenit inevitabil conștienți de care erau problemele. A fost o experiență cu adevărat îmbogățitoare, o diferență destul de mare față de zilele în care albumina serică și β-lactoglobulina (obținute de la furnizori comerciali) erau țintele principale ale cercetărilor noastre.

În cazul pompelor de ioni am intrat efectiv în fiziologie, mai ales la nivel de ipoteză sau teorie; am învățat cum să modelăm schemele cinetice cu ajutorul unui calculator; am participat la conferințele corespunzătoare; etc. Ultimul nostru concediu sabatic – la Institutul Max Planck din Heidelberg – a fost important în această privință. Președintele departamentului de fiziologie de la Duke, Ted Johnson, ni s-a alăturat cu această ocazie, astfel că eram trei dintre noi în colaborare activă . Ted era de mult timp un pasionat de calculatoare și conectase fiecare membru individual al facultății de fiziologie la instalația centrală de calculatoare din North Carolina Research Triangle înainte de a deveni la modă să se cheltuiască fondurile departamentului în acest mod. În acele vremuri trebuia să ne scriem propriile programe pentru calculator, ceea ce era dificil pentru mine, dar cred că am obținut unele rezultate utile, mai ales în ceea ce privește modelele cinetice pentru ciclul de pompare al pompei Na,K antrenate de ATP. Am lucrat la ore neortodoxe, inclusiv în weekenduri și în zilele de sărbătoare, ceea ce uneori i-a deranjat pe gazdele noastre din Heidelberg, care obișnuiau să oprească încălzirea centrală atunci când laboratorul trebuia să fie neocupat. Aproximativ o dată la zece zile treceam granița cu mașina până la Strasbourg pentru un prânz gastronomic – însoțit de vinuri alsaciene, al căror gust ne-a plăcut de atunci.

.