Gamma-Glutamil Transpeptidaza

Activitate și specificitate

Prin urmare, reacția catalizată de această enzimă este înțeleasă, în general, ca fiind transferul unei grupări γ-glutamil la o varietate de molecule acceptoare, cum ar fi apa, aminoacizii, dipeptidele și însuși donatorul de γ-glutamil, în funcție de condițiile de reacție. Aceste proprietăți catalitice sunt asociate cu mecanismul catalitic al GGT, în care reacția se desfășoară printr-un mecanism de dublă deplasare de acilare-deacelare prin intermediul unui intermediar enzimatic γ-glutamil.

Așa cum era de așteptat din structurile substratului natural glutation și ale derivaților săi, GGT recunoaște strict fracțiunea γ-glutamil, dar are o specificitate de substrat destul de largă în ceea ce privește grupul de plecare (Xaa). Glutationul, conjugații săi S, disulfura de glutation, di- sau tripeptidele γ-glutamilice, glutamina, derivații l-α-metil ai amidelor γ-glutamilice, leucotrienul C4, derivații poli-γ-glutamilici sunt toți acceptați ca substraturi . Substraturile artificiale, cum ar fi l-γ-glutamil-p-nitroanilida (l-γ-Glu-pNA) și l-γ-glutamil-7-amino-4-metilcumarina fluorescentă (l-γ-Glu-AMC) sunt substraturi active utilizate în mod obișnuit în prezența sau în absența acceptorilor de γ-glutamil (a se vedea mai jos) pentru testul transpeptidazei sau, respectiv, al hidrolazei.

Specificitatea substratului în raport cu acceptorul este cel mai mult studiată cu GGT de rinichi de șobolan . Izomerii l ai aminoacizilor neutri, cum ar fi l-cistina, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys și l-Ser, sunt buni acceptori, dar aminoacizii hidrofobi și cu lanț ramificat, cum ar fi l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile și l-Val, sunt mai degrabă substraturi slabe. d-Aminoacizii și aminoacizii α-substituiți nu acționează ca substraturi acceptori. Prin urmare, utilizarea d-γ-Glu-pNA este o modalitate convenabilă de a suprima autotranspeptidarea în măsurarea activității hidrolazei . Deoarece situsul de legare a acceptorului se suprapune cu subsite-ul pentru fracțiunea Cys-Gly a glutationului, enzima preferă dipeptidele cu Gly la C-terminal, cum ar fi l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly și l-Ser-Gly ca substraturi acceptoare în ordinea descrescătoare a activității relative. Peptidele cu mai mult de două resturi de aminoacizi sunt acceptoare foarte slabe. Valorile Km pentru aminoacizii și dipeptidele acceptoare sunt relativ ridicate, încadrându-se în intervalul 0,1-5 mM , dar Gly-Gly (Km=3 mM) este cel mai convenabil de utilizat ca substrat acceptor pentru activitatea transpeptidazei. Concentrațiile mari de molecule acceptoare inhibă GGT în mod competitiv în raport cu donatorul γ-glutamil (γ-Glu-Xaa), probabil datorită suprapunerii situsului de legare pentru Xaa și cel pentru acceptor. Specificitatea substratului în ceea ce privește subsitul Cys depinde de originea enzimei; enzima E. coli, de exemplu, preferă aminoacizii bazici (l-Arg, l-Lys și l-His) și aminoacizii aromatici (l-Phe, l-Trp și l-DOPA) la acest situs . Cu toate acestea, specificitatea acceptorului trebuie luată cu atenție, deoarece activitatea aparentă depinde, de asemenea, de concentrația efectivă a aminoacidului deprotonat disponibil la pH-ul respectiv. Activitatea relativ ridicată observată cu Gly-Gly se datorează în parte pKa-ului scăzut al acestei dipeptide . Grupurile amino deprotonate ale substraturilor acceptoare par a fi necesare pentru transpeptidare.

Substratul donor cel mai utilizat pe scară largă pentru dozarea enzimei este l-γ-Glu-pNA. Un amestec tipic de analiză pentru activitatea transpeptidazei enzimei din rinichiul de șobolan constă în 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly în 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) la 25°C. Adăugarea unei concentrații suficiente de Gly-Gly suprimă în mod eficient hidroliza și autotranspeptidarea. pH-ul optim al GGT este de aproximativ 7,5-9 pentru transpeptidare, dar dependența de pH este mult mai mică pentru hidroliză . Acest lucru este în concordanță cu faptul că activitatea aparentă a transpeptidazei depinde, în parte, de concentrația efectivă a grupului amino liber al acceptorilor.

Activitatea hidrolazei pentru glutamină este crescută de până la 12 ori prin adăugarea de modulatori direcționați spre situsul acceptorului, cum ar fi maleatul, hippuratul și glicocolatul. Adăugarea acestor compuși inhibă legarea substraturilor acceptoare și a donatorilor de γ-glutamil care ocupă subsitele Cys-Gly. Adăugarea de donatori de γ-glutamil sau legarea de inhibitori la situsul donatorului de γ-glutamil crește afinitatea acestor modulatori, indicând interacțiuni cooperative între situsurile de legare pentru donatorii de γ-glutamil și acceptori (pentru o analiză, a se vedea Tate & Meister ). Se sugerează că situsul acceptor ocupat de acești modulatori promovează o schimbare conformațională a GGT într-o formă activă, facilitând astfel formarea unei stări de tranziție. Acest lucru este, de asemenea, propus pentru a explica creșterea ratei de inactivare a enzimelor mamiferelor de către acivicină (vide infra), dar acest lucru nu a fost observat în cazul inhibării cu un γ-monofluorofosfonat, o etichetă de afinitate analogă a stării de tranziție orientată spre situsul activ . Se pare că acivicina se leagă de un reziduu nucleofilic, altul decât nucleofilul catalitic al GGT de mamifere .

GGT este inhibată în mod reversibil și competitiv de l- și d-γ-glutamil-(o-carboxil)fenilhidrazidă (anglutină, produsă de Penicillium oxalicum) cu un Ki de 8 μM și nu se raportează toxicitate acută pentru șoareci . Mai mulți analogi ai glutamatului cu o grupare reactivă în apropierea γ-carboxi acționează ca inhibitori ireversibili. 6-Diazo-5-oxo-5-oxo-l-norleucina (DON), O-diazoacetil-l-serina (l-azaserina) și acidul l-(αS,5S)-α-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazolacetic (acivicin sau AT-125, produs de Streptomyces sviceus) sunt inactivatori puternici, dar nespecifici ai GGT . Acivicina a fost utilizată pe scară largă pentru suprimarea activității GGT in vivo , deși acivicina este foarte toxică prin inactivarea unui număr de glutamină amidotransferaze implicate în biosinteza nucleotidelor, aminoacizilor și aminozaharurilor . Complexul serină-borat se leagă în mod reversibil la situsul de legare a γ-glutamilului pentru a inhiba GGT cu un Ki de 20 μM . Această constatare clasică a condus la un inhibitor puternic și cu legare lentă, acidul l-2-amino-3-boronobutanoic (γ-boroGlu) . GGT este inhibată cu un Ki global de 17 sau 35 nM, dar inhibiția este totuși reversibilă. Acidul 2-amino-4-(fluorofosfono)butanoic (γ-PFGlu), un analog al glutamatului cu un fosfor electrofil care înlocuiește γ-carboxilatul, este un puternic agent de marcare de afinitate bazat pe mecanism și orientat spre situsul activ al E. coli GGT . Acest compus inhibă rapid și ireversibil GGT pentru a forma un produs de adaos stabil, anionic și tetraedric asemănător stării de tranziție, care se pretează la cartografierea peptidelor pentru a identifica nucleofilul catalitic al E. coli GGT (vezi infra). O serie de analogi de glutamat γ-(monofenil)fosfono- și γ-fosfonodiester glutamat servesc drept inhibitori bazați pe mecanism care inhibă GGT în mod ireversibil prin modificarea covalentă a nucleofilului său catalitic. În special, γ-fosfonodiesterii care încorporează imitația structurală a Cys-Gly și gruparea carboxi C-terminală a acesteia prezintă activități extraordinar de ridicate față de GGT umană, rata de inactivare fiind de 130 până la 6000 de ori mai rapidă decât cea a acivicinei. Inhibarea este selectivă pentru GGT și nu se observă nicio toxicitate. Unul dintre acești inhibitori este disponibil în comerț sub denumirea de „GGsTop” (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Un inhibitor al analogului non-glutamat al GGT uman este găsit prin screening de mare capacitate . Acest compus ocupă situsul acceptor al complexului substratului γ-glutamil cu un Ki de 17,6 μM. Inhibitorul este selectiv în funcție de specie, dar este reversibil și se raportează o oarecare toxicitate.

Se crede că reacția catalizată de GGT se desfășoară cu un mecanism de ping-pong prin intermediul unui intermediar γ-glutamil-enzimatic, așa cum se observă în cazul serin-hidrolazelor . Thr Oγ N-terminal din subunitatea mică este nucleofilul catalitic la care este atașată o grupare γ-glutamil (vezi Chimie structurală). Nucleofilul catalitic al GGT a fost identificat pentru prima dată la E. coli GGT ca fiind reziduul Thr N-terminal (Thr391) în subunitatea mică prin cartografierea peptidică a enzimei inactivate cu γ-PFGlu . Acest reziduu, care corespunde la Thr380 (enzima din rinichiul de șobolan) și Thr381 (enzima umană), este conservat la toate GGT-urile ale căror secvențe primare sunt cunoscute. Nucleofilul catalitic al GGT umane este identificat ca fiind Thr381 prin cartografierea peptidică a enzimei inactivate cu eticheta de afinitate γ-(monofenil)fosfono . Prin urmare, reacția catalizată de GGT începe cu atacul nucleofilic al reziduului Thr N-terminal din subunitatea mică asupra γ-carboxilului unui substrat donor (γ-Glu-Xaa) pentru a elimina Xaa. Enzima γ-glutamil astfel formată reacționează cu apa (hidroliză) sau cu aminoacizi și dipeptide (transpeptidare și autotranspeptidare) în etapa care determină viteza .

GGT este un membru al hidrolazelor nucleofile N-terminale (Ntn-hidrolaze), așa cum a fost prezis de pliul său unic și de procesul de maturare, în care o formă dimerică activă de enzimă matură este generată prin procesarea autocatalitică post-translațională a precursorului inactiv din punct de vedere catalitic. Acest lucru este confirmat prin mutageneză dirijată de situs și prin analiza structurală cu raze X a enzimelor bacteriene (vezi Chimie structurală).

.