— FRAPcms

FRAP este o metodă de microscopie cu fluorescență pentru studierea mobilității moleculelor marcate cu fluorescență în celulele vii. Se aplică pentru analiza difuziei moleculelor în interiorul celulei, a fluidității membranelor biologice și a legării proteinelor.

Principiu:

FRAP poate fi realizată cu ajutorul unui microscop confocal modern. Este nevoie de marcarea fluorescentă a moleculei de interes, de către un anticorp marcat cu GFP, de exemplu. Un experiment FRAP tipic implică trei faze distincte. În primul rând, se măsoară fluorescența inițială în regiunea de interes. Apoi, moleculele fluorescente sunt fotoblurate într-o zonă selectată. Acest lucru se realizează prin focalizarea fasciculului laser pe zona respectivă, ceea ce duce la iluminarea intensă și la stingerea fluoroforilor. Ca urmare, se poate observa o zonă întunecată în proba care altfel ar fi fost fluorescentă. În cele din urmă, moleculele fluorescente din mediul înconjurător pot să difuzeze prin probă și să schimbe moleculele fotoblurate cu cele intacte. Această recuperare a fluorescenței se măsoară în timp.

Din moment ce mulți factori pot influența cinetica de recuperare, experimentele FRAP trebuie să fie bine planificate, iar datele rezultate trebuie analizate cu atenție. Este apoi posibil să se obțină coeficientul de difuzie și parametrii de mobilitate a moleculelor folosind modelarea matematică.

.