EzColocalization: Un plugin ImageJ pentru vizualizarea și măsurarea colocalizării în celule și organisme

Vizualizare generală a fluxului de lucru EzColocalization

Fluxul de lucru pentru EzColocalization este împărțit în patru module, fiecare cu propria filă în GUI. Filele sunt:: (i) „Intrări”, unde sunt selectate și aliniate imagini, măști sau liste de regiuni de interes (ROI); (ii) „Filtre de celule”, unde celulele pot fi selectate pe baza caracteristicilor fizice și a intensității semnalului; (iii) „Vizualizare”, unde sunt create hărți termice, diagrame de dispersie și matrici metrice (definite mai jos); și (iv) „Analiză”, unde sunt alese metricele de colocalizare și rezultatele. Nu toate modulele și nu toate procesele din cadrul unui modul trebuie să fie utilizate. Unele file au un buton „Preview” (Previzualizare) pentru a rula un anumit modul în loc de butonul „Analyze” (Analiză) care rulează toate procesele selectate în toate modulele.

Intrări

Filele de imagine, care sunt alese în fila „Inputs” (Fig. 1A), trebuie să fie: (i) monocromatice (adică nu în formate RGB sau CMYK); (ii) pe 8, 16 sau 32 de biți; și (iii) într-un format, cum ar fi TIFF, care păstrează valorile originale ale intensității pixelilor. Imaginile de mari dimensiuni pot fi comprimate pentru transferul de fișiere folosind un format fără pierderi, cum ar fi ZIP sau LZW, și apoi decomprimate pentru analize. În plus față de imagini, EzColocalization poate accepta măști și liste ROI pentru identificarea celulelor (a se vedea mai jos). Dacă există mai multe imagini pentru fiecare canal, imaginile trebuie să fie stivuite pentru o analiză mai eficientă în meniul „Stack” (consultați ghidul ImageJ pentru mai multe detalii24). Imaginile dintr-o stivă pot fi diferite câmpuri de vizualizare sau o serie temporală, dar trebuie să aibă aceleași dimensiuni, mărire și ordine a imaginilor pentru fiecare canal. Fișa de intrare oferă, de asemenea, opțiuni pentru stabilirea pragurilor pentru intensitatea semnalului și alinierea imaginilor nealiniate din canale diferite (Fig. 1B și Informații suplimentare). Recomandările pentru achiziționarea de imagini adecvate pentru analiza colocalizării sunt furnizate în Informații suplimentare. Notă: alinierea funcționează pe baza presupunerii că se poate alege un prag adecvat pentru intensitatea semnalului pentru a distinge pixelii din interiorul și exteriorul celulelor; dacă pragurile includ zone din afara celulei sau doar o zonă limitată din interiorul celulelor, atunci este posibil ca alinierea să nu funcționeze corect. Din acest motiv, toate alinierile trebuie verificate vizual prin examinarea ROI-urilor pentru a confirma că sunt selectate zonele corespunzătoare ale celulelor.

EzColocalization este conceput în primul rând pentru un canal de „identificare a celulelor” și două sau trei imagini de canal „reporter”. Cu toate acestea, poate funcționa cu alte combinații de intrare (tabelul S1). Canalul de identificare a celulelor este utilizat pentru a identifica celulele individuale și, în consecință, pentru a distinge pixelii intracelulari și extracelulari. Canalul de identificare a celulelor poate fi orice tip de imagine care permite identificarea limitelor celulelor, inclusiv: imagini de microscopie luminoasă (de exemplu, contrast de fază25,26 și câmp luminos), imagini cu un reporter care marchează membrana celulară sau care se află în întreaga citoplasmă (de exemplu, Cy5, Fig. 1B) și imagini cu un colorant extracelular care conturează celulele. Imaginile cu contrast interferențial diferențial de interferență (DIC) creează umbre care îngreunează selecția automată a celulelor cu ajutorul metodelor de prag27; prin urmare, pentru imaginile DIC, recomandăm ca ROI-urile să fie create cu ajutorul „instrumentelor de selecție” din ImageJ pentru a contura manual zonele de celule, iar apoi să le adăugați la o listă prin alegerea „Add to Manager” (în submeniul „Selection” din meniul „Edit”). După ce sunt selectate ROI pentru toate celulele de interes dintr-o imagine, se poate crea o mască binară folosind funcțiile „Clear Outside” și „Autothreshold” din ImageJ.

Cell Filters

Filetul „Cell Filters” este utilizat pentru a ajuta la selectarea celulelor în imagini (Fig. 2A) și pentru a distinge pixelii intracelulari și extracelulari. Celulele sunt identificate prin: (i) alegerea unuia dintre algoritmii de prag ImageJ24 sau selectarea manuală a pragurilor (care se face prin selectarea „*Manual*” dintr-o listă derulantă din fila Inputs (Intrări) și apăsarea butonului „Show threshold(s)” (Afișați pragul (pragurile)), pentru a identifica regiunile care corespund celulelor în canalul de identificare a celulelor (Fig. 2B); (ii) utilizarea segmentației watershed pentru a separa obiectele care se ating în imaginile canalului de identificare a celulelor (opțional) (Fig. 2B); (iii) selectarea obiectelor din imaginile canalului de identificare a celulelor pe baza parametrilor fizici (Fig. 2C) și a intensității semnalului (Fig. 2D). EzColocalization va încerca să detecteze automat dacă imaginile de intrare au un fundal întunecat sau deschis folosind skewness. Presupunând că există mai mulți pixeli în fundal decât în celule, o imagine cu skewness pozitiv indică un fundal întunecat, iar skewness negativ indică un fundal deschis. Utilizatorii pot, de asemenea, să selecteze manual dacă imaginile de intrare au un fundal închis sau deschis în opțiunile „Parameters…” din meniul „Settings”. Celulele care se află doar parțial în interiorul unei imagini și, prin urmare, ar putea furniza valori înșelătoare, sunt eliminate automat din analize.

EzColocalization are un „Pre-watershed filter” opțional și opt filtre post-watershed opționale (cu posibilitatea de a selecta mai multe). Segmentarea Watershed poate ajuta la separarea celulelor care se divid și a celor care se ating28 , dar poate, de asemenea, să împartă obiecte mari, cum ar fi agregatele de material extracelular, în fragmente mai mici care au aceeași dimensiune ca și celulele. Pentru a evita acest din urmă caz, se poate utiliza filtrul Pre-watershed (Pre-watershed filter) pentru a exclude din analiză obiectele cu suprafețe mari. Butonul Preview (Previzualizare) din fila Cell Filters (Filtre de celule) permite utilizatorilor să vadă ce obiecte de pe imaginea curentă vor fi selectate atunci când se ajustează limitele minime și maxime ale tuturor filtrelor. Există două clase de parametri pentru filtrele celulare post-watershed (tabelul S2): (i) parametri fizici bazați pe măsurătorile din canalul de identificare a celulelor; și (ii) parametri de intensitate a semnalului din canalele reporterilor. Parametrii fizici se aplică tuturor canalelor, în timp ce parametrii de intensitate a semnalului se aplică numai canalului reporter pentru care sunt selectați (deoarece reporterii pot avea niveluri foarte diferite de semnal). În plus față de filtrarea bazată pe opțiunile predefinite în ImageJ, EzColocalization are filtre pentru „MeanBgndRatio” sau „MedianBgndRatio”, care se calculează prin împărțirea intensității medii sau mediane a semnalului pixelilor din interiorul unui obiect la intensitatea medie sau mediană a semnalului respectiv al pixelilor extracelulari.

Vizualizare

Fila „Visualization” afișează semnalele sau metricile din celule ca: (i) „heat maps” (hărți de căldură); (ii) scatterplots (diagrame de dispersie); și (iii) „metric matrices” (matrici metrice) (Fig. 3A).

Heat maps (hărți de căldură) sunt imagini pseudocolorate care arată magnitudinea relativă a semnalelor reporterilor (Fig. 3B). Ele sunt generate prin normalizare și redimensionare astfel încât valorile minime și maxime ale pixelilor să fie 0 și, respectiv, 255 în fiecare celulă, imagine sau stivă. Există opt opțiuni pentru colorarea hărților termice, iar valorile de intensitate pentru fiecare culoare sunt obținute din funcția „Show LUT” (din cadrul submeniului „Color” al meniului „Image” din ImageJ). Hărțile termice celulare sunt potrivite pentru a determina unde fiecare raportor apare cu cea mai mare intensitate în celule. Hărțile termice ale imaginilor pot arăta dacă diferite celule dintr-un câmp de vizualizare au intensități substanțial diferite, ceea ce poate indica eterogenitate biologică sau neuniformitate în etichetare. Hărțile termice ale stivei pot arăta dacă celulele din diferite imagini au niveluri substanțial diferite de intensitate a semnalului, ceea ce poate indica neuniformitatea marcării sau a măsurătorilor pe o lamelă (de exemplu, din cauza fotodepășirii) sau modificări ale semnalului în timp (în cazul în care stiva este o serie cronologică). Notă: aspectul hărților termice este afectat de setările de luminozitate și contrast.

Scatterplots arată relația dintre intensitatea semnalului pentru două sau trei canale reporter pentru celule și imagini individuale (Fig. 3C). Această relație este importantă în alegerea metricii de colocalizare adecvate (Informații suplimentare). Diagramele de dispersie pot dezvălui, de asemenea, eterogenitatea modelelor de localizare8, ceea ce poate necesita eliminarea pixelilor de fundal sau analize separate pentru diferite tipuri de celule.

Matricele metrice oferă o imagine de ansamblu a modelelor de localizare prin prezentarea valorilor calculate ale unei metrici de colocalizare pentru mai multe combinații de praguri. Matricile metrice pentru scorul de suprapunere a pragului (TOS) s-au dovedit a fi utile pentru analiza modelelor de localizare pentru două canale reporter8,15 (Fig. 3D). Pentru a fi complet, EzColocalization are opțiunea de a calcula matrici metrice pentru două canale reporter folosind alte cinci metrici: scorul de suprapunere a pragului cu scalare logaritmică8, coeficientul de corelație Pearson (PCC), coeficienții de colocalizare Manders (M1 și M2), coeficientul de corelație de rang Spearman (SRCC) și coeficientul de corelație a intensității (ICQ)8,15. Colocalizarea pentru trei canale poate fi, de asemenea, măsurată folosind ICQ, coeficienții de colocalizare Manders’ și TOS29 (Informații suplimentare).

Subliniile pentru toate metricile sunt măsurate ca percentila superioară (FT) a pixelilor pentru intensitatea semnalului8,15. De exemplu, FT = 0,1 reprezintă cei 10% de pixeli cu cel mai mare semnal. Pentru matricile metrice, FT este, de asemenea, utilizat pentru a specifica dimensiunea pasului pentru combinațiile de praguri. Altfel spus, FT = 0,1 selectează, de asemenea, pragurile pentru 10%, 20%, …, și 100% din pixelii cu cel mai mare semnal. Dacă FT nu se împarte în mod egal în 100, atunci procentul rămas este ultima dimensiune a pasului. Pentru metricile care nu au nevoie de un prag (de exemplu, PCC, SRCC și ICQ), valorile sunt calculate presupunând că există doar pixelii care se află deasupra pragurilor. Fereastra matricei metrice are opțiuni pentru salvarea rezultatelor sub formă de text sau de imagine, pentru modificarea FT sau a tipului de metrică, pentru vizualizarea valorilor metrice ale celulelor individuale sub formă de listă și pentru calcularea mediei, a medianei sau a modului metricii pentru fiecare combinație de praguri. Butonul „Proc” (procesat) și „Raw” (brut) determină dacă lista de date afișată, copiată sau salvată cu ajutorul butoanelor „List” (listă), „Copy” (copie) sau, respectiv, „Save…” (salvare) este valoarea medie a eșantionului pentru fiecare combinație de praguri (de exemplu, valoarea mediană) sau toate valorile pentru fiecare celulă din eșantion pentru toate combinațiile de praguri.

Analysis

Fila „Analysis” (analiză) are trei subfișe („Analysis Metrics” (măsurători de analiză), „Metrics Info” (informații despre măsurători) și „Custom” (personalizat)). Subfila „Analysis Metrics” are șase metrici pentru măsurarea colocalizării pentru doi reporteri (Fig. 4A) și trei metrici pentru trei reporteri (a se vedea secțiunea anterioară). Utilizatorii pot alege un prag sau niciun prag pentru PCC, SRCC și ICQ. Coeficienții de colocalizare TOS și Manders trebuie să aibă un prag pentru a fi calculați. Subtab-ul Metrics Info conține informații și resurse despre metricile utilizate în subtab-ul Analysis Metrics (mai multe detalii în Supplementary Information). Pragurile pot fi selectate utilizând metoda lui Costes30 sau manual. În subfila Custom (Personalizat) (a se vedea Informații suplimentare pentru informații suplimentare), utilizatorii își pot scrie propriul cod în JavaTM pentru a analiza imaginile (notă: exemplul furnizat este pentru calcularea PCC) (Fig. 4B). Butonul „Compile” (Compilați) testează codul și creează un fișier temporar în directorul temporar Java și afișează rezultatul compilării cu o etichetă „Succeeded” (A reușit) sau „Failed” (A eșuat). În caz de succes, codul personalizat compilat se citește din nou în memorie și se aplică celulelor selectate.

Lovitura fiecărei analize este un tabel care specifică imaginea și un număr de identificare pentru fiecare celulă (Fig. 4C), iar pentru fiecare celulă sunt furnizate valori pentru: (i) metrica selectată; (ii) parametrii fizici; și (iii) intensitatea medie a semnalului pentru fiecare canal (dacă este selectată). Notă: „NaN” în tabelul de ieșire indică faptul că nu s-a reușit calcularea unei valori. Utilizatorii pot genera, de asemenea, ferestre de rezumat (cu numărul de celule, media, mediana și deviația standard pentru metrica selectată) (Fig. 4D), histograme ale valorilor metrice (Fig. 4E), imagini cu măști binare și o listă de ROI care reprezintă poziția și numărul fiecărei celule pe fiecare imagine din managerul ROI. Listele ROI și imaginile cu măști binare pot fi salvate pentru o nouă analiză a acelorași celule.

Aplicații ale EzColocalization

EzColocalization este conceput pentru a fi utilizat într-o manieră modulară pentru a facilita personalizarea analizelor pentru o mare varietate de experimente și nevoi ale cercetătorilor. Această secțiune se concentrează pe demonstrarea unor instrumente specifice din EzColocalization pentru a rezolva probleme din lumea reală în diverse seturi de imagini.

În prima aplicație a EzColocalization, sunt folosite pentru a demonstra imagini ale neuronilor hipocampali de șobolan din Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, care sunt atribuite lui Dieter Brandner și Ginger Withers): (i) utilizarea unui canal reporter pentru identificarea celulelor atunci când un experiment nu dispune de imagini separate non-reporter pentru identificarea celulelor; (ii) filtre de celule pentru selectarea celulelor; și (iii) instrumente de vizualizare pentru alegerea parametrilor. Fluxul de lucru al analizei este prezentat în Fig. 5A. În prima etapă, au fost create două stive de imagini reporter: o stivă cu imagini în care este marcată F-actina (utilizând o peptidă de faloidină conjugată cu rodamina); și a doua stivă cu imagini în care este marcată tubulina (utilizând un anticorp conjugat cu Alexa 488) (Fig. 5B) (Fig. 5B). Interacțiunea dintre F-actina și tubulina este importantă pentru creșterea și migrarea neuronilor31,32. Am utilizat imaginile cu F-actina pentru identificarea celulelor, deoarece aceasta este prezentă în toate celulele și arată limitele celulelor8. Celulele individuale au fost selectate din imaginile F-actină prin aplicarea unui prag pentru identificarea celulelor24 și prin utilizarea unui filtru celular pentru a elimina resturile celulare (notă: valorile parametrilor din Fig. 5A).

După ce celulele au fost selectate, intensitatea semnalelor reporterilor a fost examinată cu ajutorul hărților termice celulare și a diagramelor de dispersie. Am constatat că raportorii nu s-au colocalizat la niveluri ridicate de semnal și că a existat o relație complexă între intensitățile semnalelor (Fig. 5C,D). Datorită acestui din urmă aspect, localizarea a fost cuantificată utilizând M1 și M2 și TOS de Manders (Informații suplimentare). M1 și M2 au fost evaluate la pragurile selectate prin metoda lui Costes pentru celula descrisă în Fig. 5B, iar valorile au fost de 0,289 și, respectiv, 0,995. Aceste valori sunt de obicei interpretate ca indicând faptul că tubulina are o colocalizare ridicată cu F-actina, iar F-actina are o colocalizare scăzută cu tubulina. Valorile TOS au fost evaluate prin generarea unei matrice metrice cu valorile TOS mediane. Matricea a arătat colocalizarea, anticolocalizarea și necolocalizarea la diferite praguri pentru intensitățile de semnal ale tubulinei și F-actinei (Fig. 5E). În locurile din celule în care F-actina și tubulina au semnalul de cea mai mare intensitate (primii 10% de pixeli pentru fiecare canal), valoarea mediană TOS este de -0,36 (n = 20). Această valoare negativă indică anticolocalizare, ceea ce este în concordanță cu impresia obținută din hărțile termice și diagramele de dispersie, precum și cu alte rapoarte8.

În cea de-a doua aplicație, au fost obținute imagini de Saccharomyces cerevisiae în timpul mitozei din Cell Image Library33 pentru a demonstra: (i) identificarea celulelor prin contururi desenate manual (pentru experimentele în care nu se pot aplica metode automate de identificare a celulelor); și (ii) alinierea imaginilor. Datele de intrare ale reporterilor au fost o imagine de la o tulpină de tip sălbatic („control”; CIL: 13871) care are proteina BFA1 care încarcă TEM1 pe corpul polului fusiform, și o imagine de la o tulpină fără proteina BFA1 (mutant cu deleție ∆bfa1; CIL: 13870). În aceste imagini reporter, celulele au exprimat proteina TEM1 fuzionată cu GFP, iar ADN-ul a fost marcat cu DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindol). TEM1 se localizează la corpurile polilor fusiformi în timpul mitozei și este implicată în declanșarea ieșirii din mitoză33. Fluxul de lucru este prezentat în Fig. 6A. În această aplicație, ROI-urile au fost trasate manual în jurul celulelor cu ajutorul instrumentului de selecție „Freehand” din ImageJ pe imaginile DIC. Măștile binare, care au fost utilizate pentru a selecta zonele de celule, au fost create prin selectarea ROI-urilor și prin utilizarea funcțiilor „Clear Outside” și apoi „Auto Threshold” din ImageJ24 (Fig. 6B). Zonele celulare au fost utilizate pentru identificarea celulelor și pentru a corecta alinierea între imaginile DIC și canalele reporterilor utilizând algoritmul de prag „Default” (Fig. 6C). În urma acestei identificări a celulelor și a alinierii imaginilor, imaginile sunt acum pregătite pentru vizualizare și analiză, așa cum a fost descris în exemplul anterior.

În cea de-a treia aplicație, imaginile de Caenorhabditis elegans adulți întregi obținute din Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 au fost folosite pentru a demonstra că: (i) EzColocalization poate analiza colocalizarea în organisme întregi; și (ii) filtrele „cell” pot selecta organisme individuale pe baza intensității semnalului reporterului. Imaginile din acest exemplu provin din același set de date utilizat în studiul nostru care descrie TOS (dar nu sunt aceleași imagini)8. Fluxul de lucru este prezentat în Fig. 7A. Contururile de C. elegans individuale au fost desenate în ImageJ pe imaginile în câmp luminos pentru a crea ROI-uri, iar ROI-urile au fost adăugate la managerul ROI pentru identificarea „celulei”. GFP exprimată de promotorul clec-60 în intestinul anterior a fost reporter 1, iar mCherry exprimată de promotorul myo-2 în interiorul faringelui, care este un organ de lângă intestinul anterior35 , a fost reporter 2. Filtrele celulare pentru parametrii fizici nu au fost necesare, deoarece numai obiectele considerate adecvate pentru C. elegans aveau contururi desenate în jurul lor în primul rând. Cu toate acestea, filtrele de celule pentru intensitatea semnalului au fost necesare deoarece unii C. elegans aveau un semnal GFP scăzut, posibil din cauza reducerii la tăcere a transgenei36,37 (Fig. 7B). Vizualizarea și analiza ulterioară pot fi efectuate așa cum este descris în prima aplicație.

În cea de-a patra aplicație, demonstrăm analiza colocalizării pentru trei canale reporter. Fluxul de lucru a fost același ca pentru două canale reporter, cu excepția faptului că „3 canale reporter” a fost selectat mai întâi în meniul principal „Settings” (Setări) (Fig. 8A). Imaginile au fost obținute din Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, versiunea 1, set de imagini: 37983, imagine: p23_s9) de celule de cancer osos U2OS (n = 66)38. Cele trei imagini reporter au avut ADN, reticulul endoplasmatic (ER) și, respectiv, mitocondriile colorate cu Hoechst 33342, concanavalin A/Alexa Fluor488 conjugat și MitoTracker Deep Red (rândul superior, Fig. 8B). Identificarea celulelor a fost realizată cu o imagine a membranei plasmatice marcată cu agglutinină din germeni de grâu (WGA)/conjugat Alexa Fluor 555 (stânga sus, Fig. 8B). Notă: în imagine au fost marcate, de asemenea, aparatul Golgi și rețeaua F-actină38. Membrana plasmatică a fost trasată cu ajutorul instrumentului de selecție poligonală din ImageJ pentru a crea ROI-uri pentru celulele individuale, iar managerul ROI care conținea ROI-urile a fost selectat pentru identificarea celulelor.

Planurile de localizare au fost vizualizate în același mod ca și în cazul celor doi reporteri, cu excepția faptului că: (i) există trei seturi de hărți termice pentru raportori în loc de două (rândul inferior, Fig. 8B); și (ii) diagramele de dispersie și matricile metrice sunt în trei dimensiuni (Fig. 8C-F). Există opțiunea în tabul Vizualizare și în tabul Analiză (Fig. 8G) de a măsura colocalizarea pentru cei trei raportori folosind ICQ, TOS sau metricile M1, M2 și M3 ale lui Manders. Dintre cei trei parametri, am constatat că TOS a fost cel mai ușor de interpretat. TOS are o singură valoare pentru măsurarea colocalizării tuturor celor trei semnale ale reporterilor și a arătat în mod clar că semnalele reporterilor pentru nucleu, mitocondrie și ER s-au suprapus la praguri scăzute (adică la valori FT ridicate există colocalizare; culoare roșie în Fig. 8E) și nu s-au suprapus la praguri ridicate (adică la valori FT scăzute există anticolocalizare; culoare albastră în Fig. 8E). Aceste observații sunt în concordanță cu faptul că nucleul, mitocondriile și organitele ER se suprapun la marginile lor (unde semnalul de la reportofoanele lor este de obicei mai mic) datorită interacțiunilor fizice cunoscute, dar nu și la centrele lor (unde semnalul de la reportofoanele lor este de obicei mai mare), deoarece acestea sunt structuri distincte în celule39,40,40,41.

.