Electroporarea și metodele concurente de transfecție

Angelo DePalma Ph.D. Writer GEN

Pentru că este versatilă – funcționează cu orice celulă, orice organism – electroporarea este deosebit de avantajoasă.

Electroporarea folosește un impuls electric pentru a introduce noi specii, de obicei molecule polare, în celule. Tehnica exploatează interacțiunile slabe dintre bistraturile fosfolipidice care mențin integritatea membranelor celulare. Într-o membrană celulară tipică, fosfolipidele sunt aranjate cu grupurile lor polare de cap îndreptate spre exterior și cu grupurile hidrofobe de coadă îndreptate spre interior, un aranjament care împiedică trecerea moleculelor polare. Fără un anumit tip de asistență, moleculele polare nu pot intra.

Când celulele experimentează un impuls electric controlat, stratul de fosfolipide se deschide, creând canale fizice temporare care permit moleculelor să intre. În condiții adecvate, canalele se închid rapid, readucând celula la starea inițială – cu excepția faptului că celula conține acum molecule străine.

În plus față de introducerea directă a genelor, electroporarea facilitează transferul direct de plasmide între celule sau specii – de exemplu, de la bacterii la drojdie.

Continuă experimentele extinse privind utilizarea electroporării pentru administrarea de medicamente și vaccinuri direct în celulele organismelor vii. Acest articol se concentrează asupra aplicațiilor nemedicale.

Electroporarea este cel mai frecvent utilizată pentru a transfecta celulele în mod tranzitoriu, deși este posibilă și transfecția stabilă. În industria biofarmaceutică, transfecția tranzitorie permite producerea a până la câteva grame de proteine pentru caracterizare și studii preclinice. În această aplicație, electroporarea care utilizează plasmide s-a dovedit a fi fiabilă și previzibilă. În mod similar, electroporarea produce celule transfectate în mod stabil, cu condiția ca ADN-ul să fie introdus în formă liniarizată prin tratarea prealabilă cu o enzimă de restricție.

O tehnică printre multe

Electroporarea este ferm stabilită în armamentariul tehnicilor de transfecție care includ vectori virali, metode chimice sau bazate pe reactivi și livrarea mecanică de gene. Vectorii virali sunt cea mai comună metodă de generare de celule transfectate în mod stabil pentru fabricarea de proteine terapeutice. Vectorii virali oferă o eficacitate de transfecție foarte mare, dar sunt limitați în ceea ce privește lungimea ADN-ului inserat. Vectorii virali se confruntă, de asemenea, cu probleme legate de biosecuritate și mutageneză.

Se folosesc experimental și alte tehnici mecanice, cum ar fi microprecipitarea, microinjecția, lipozomii, bombardamentul cu particule, sonoporarea, porarea indusă de laser și transfecția cu bile. Aceste tehnici mecanice au un punct comun. Ele perturbă membranele celulare și, astfel, permit ADN-ului să pătrundă în celulă. Unele abordări – „tunul de gene”, de exemplu – implică proiecția de gene direct prin membrană în citoplasmă. De aici, genele pot migra spre nucleu.

În plus, există tehnici hibride care exploatează capacitățile metodelor mecanice și chimice de transfecție. De exemplu, în ultimul deceniu au apărut numeroase articole despre magnetofecție, o metodologie de transfecție care combină transfecția chimică cu metodele mecanice. De exemplu, lipidele cationice pot fi utilizate în combinație cu tunuri de gene sau electroporatori. Cea mai mare parte a literaturii despre magnetofecție implică livrarea de gene și molecule terapeutice în organisme vii.

Electroporarea are mai multe avantaje: versatilitate (funcționează cu orice tip de celule), eficiență, cerințe foarte scăzute de ADN și capacitatea de a opera în organisme vii. Dezavantajele includ potențiale leziuni celulare și transportul nespecific al moleculelor în interiorul și în afara celulei.

Dar, printre abordările de transfecție chimică, mecanică și virală, doar electroporarea oferă o certitudine rezonabilă de succes, indiferent de celula sau organismul țintă.

De exemplu, transformarea chimică și electroporarea sunt două metode principale pentru introducerea ADN-ului în Escherichia coli. Pentru aceasta din urmă, bacteriile trebuie mai întâi să fie făcute „competente” prin îndepărtarea sărurilor tampon pentru a se asigura că curentul ajunge la celule, urmată de aplicarea impulsului electric la 0°C pentru a reduce deteriorarea microorganismelor. Transformarea chimică implică suspendarea în CaCl2, care creează pori, urmată de un șoc termic care mătură ADN-ul în celule.

O altă abordare folosește lipide cationice pentru a deschide membranele celulare. Electroporarea este mai puțin greoaie și mai eficientă, funcționează pe tipuri de celule mai variate și se pretează mai ușor la metode standard decât transfecția chimică. Cu toate acestea, unii cercetători preferă transformarea chimică, deoarece nu necesită achiziționarea unui instrument.

Încadrarea inovației

Deși a fost descrisă pentru prima dată în 1965, electroporarea continuă să deschidă căi spre o știință inovatoare în ceea ce privește instrumentația, protocoalele și experimentul. Cel puțin o duzină de grupuri universitare au dezvoltat dispozitive de electroporare bazate pe sisteme microelectromecanice (MEMS). Un avantaj al dispozitivelor cu microcanale este că acestea pot fi proiectate pentru a nu aplica o tensiune mai mare decât cea suficientă pentru a obține o încorporare rezonabilă a macromoleculelor. Acest avantaj este, de asemenea, un dezavantaj. Spre deosebire de sistemele comerciale de electroporare, cipurile nu funcționează cu toate celulele.

Un grup de la Departamentul de Inginerie Biomedicală, Louisiana Tech University, condus de Shengnian Wang, Ph.D., a descoperit că nanoparticulele de aur îmbunătățesc performanța echipamentelor comerciale de electroporare.1 Wang crede că particulele, care sunt foarte conductive, reduc conductivitatea mediului celular, acționând în același timp ca „microelectrozi virtuali” pentru a ajuta la deschiderea membranelor fosfolipidice. El susține o performanță sporită (eficiență îmbunătățită de livrare a ADN-ului) și o viabilitate celulară mai mare în virtutea unor tensiuni de porație mai mici.

Cercetătorii de la Charité Universitätsmedizin Berlin2 au dezvoltat o strategie combinată de electroporare cu impulsuri pătrate pentru transfecția reproductibilă a celulelor. Britta Siegmund, M.D., și colaboratorii săi suspendă celulele în tampon și le supun unui impuls inițial de înaltă tensiune urmat de un impuls de joasă tensiune cu valoare electrică și temporală diferită. Dr. Siegmund susține că viabilitatea este comparabilă cu electroporarea standard și că eficiența transfecției este de până la 95%. Ea concluzionează că tehnica poate fi „ușor adaptată pentru celulele considerate dificil de transfectat.”

În plus față de transferul obișnuit de ADN, transfecția a fost folosită pentru a introduce ARN de interferență în diferite tipuri de celule. Tehnica permite studiul controlat, la scară mică, al dozării și eficienței de livrare. Problemele legate de dozare și livrare au afectat aplicațiile practice ale interferenței ARN în terapie. Dar cel puțin un studiu a pus sub semnul întrebării dacă genele de interferență ARN sunt încorporate cel mai eficient prin reactivi de transfecție sau prin electroporare în celulele primare.3

Kirsty Jensen, Ph.D., și colegii săi de la Universitatea din Edinburgh au comparat eficacitatea a 11 kituri de reactivi de transfecție tranzitorii și electroporare pentru reducerea la tăcere a genei imunomodulatoare a febrei mediteraneene (MEFV) în macrofagele bovine derivate din monocite. Grupul a testat metodologiile de absorbție a ARN mic de interferență, de eliminare a genei țintă, de toxicitate celulară și de inducere a răspunsului interferonului de tip I.

Electroporarea a fost aproximativ la fel de eficientă în eliminarea MEFV ca și reactivii de transfecție. Spre deosebire de reactivi, electroporarea nu a indus niciun răspuns de interferon, dar viabilitatea celulară a fost mai scăzută. Problemele legate de viabilitatea și eficiența transfecției pentru electroporare sunt, în general, luate ca o evaluare la prima vedere a tehnicii.

Dr. Jensen a concluzionat că „utilizarea reactivilor de transfecție este mai potrivită decât electroporarea pentru munca noastră de investigare a rolului genelor macrofagelor gazdă în răspunsul la infecție”, dar că „alegerea transfectării sau electroporării ARN-ului mic de interferență în celule depinde de experimentele individuale.”

În cel puțin unele cazuri în care rezultatele electroporării sunt suboptime, cercetătorii au neglijat să optimizeze alte condiții decât intensitatea impulsurilor electrice. După cum au observat recent Hu și colaboratorii4 , eficacitatea electroporării este influențată de factori neelectrici, cum ar fi tipul de celule sau de țesuturi și formularea ADN.

Electroporarea a devenit o metodă indispensabilă atât pentru biologia dezvoltării in vitro, cât și in vivo. O bună parte din această activitate are loc în celule unice, contribuind la un model de mare interes în terapeutică, diagnosticare, administrare de medicamente și biologie celulară. Nanoporarea directă a celulelor unice este dificilă din cauza incertitudinii inerente viabilității post-porare.

Cercetătorii de la Northwestern University au dezvoltat o tehnică monocelulară care asigură o viabilitate și o eficiență ridicate.5 Abordarea lor utilizează un dispozitiv cantilever microfabricat, sonda nanofântână (NFP). Aceasta livrează moleculele către celule cu mai multă delicatețe decât microinjecția în masă sau nanoporarea. Cercetătorii au demonstrat electroporarea mediată de NFP a celulelor HeLa individuale cu o eficiență de transfecție mai bună de 95%, o viabilitate de 92% și un control calitativ al dozei.

NFP-urile reprezintă o îmbunătățire față de tehnologiile de transfecție mai vechi care utilizează sonde de microscop de forță atomică. Tehnicile bazate pe microscopia de forță atomică determină adesea pierderea atașamentului sau ruperea celulelor. NFP provoacă mai puține daune celulelor.