Derivația chimică în bioanaliză

Aplicații

Derivația chimică s-a dovedit de mult timp o tehnică analitică în bioanaliză pentru a depăși problemele asociate cu eficiența scăzută a ionizării, instabilitatea compușilor, selectivitatea slabă sau performanța cromatografică inacceptabilă (retenție slabă, formă proastă a vârfului și probleme de carryover) și chiar volatilitate slabă pentru separarea GC. Această tehnică este un instrument puternic în multe domenii ale chimiei, inclusiv în medicină, criminalistică, știința alimentară, controlul dopajului și disciplinele de mediu. Scopul derivatizării chimice este de a modifica structura analitului (fie un nucleofil, fie un electrofil) cu ajutorul unui reactiv chimic (fie un electrofil, fie un nucleofil, în funcție de natura analitului) și, ca rezultat, se formează un nou compus (derivatul reacției) cu proprietăți chimice și fizice îmbunătățite pentru analiză. Condițiile de reacție (cantitatea de reactiv, timpul și temperatura de reacție etc.) sunt optimizate în favoarea formării derivatului dorit cu un randament de reacție cât mai mare posibil. Pot fi dezvoltate proceduri suplimentare de curățare a probelor pentru a elimina subprodusele nedorite și reactivii în exces, minimizând astfel inferențele de analit la analiză.

Utilizând derivatizarea chimică, analiza imposibilului devine posibilă. Multe exemple în acest sens au fost prezentate în literatura de specialitate; cu impact asupra detecției GC, LC-MS/MS și RMN. Cea mai notabilă a fost separarea cromatografică a enantiomerilor prin derivatizare chirală folosind reactivi de rezolvare specifici, fără a utiliza coloane chirale specializate și condiții de separare.

Considerații

Selecția reactivului chimic adecvat este esențială pentru o derivatizare reușită și depinde de aplicația specifică. În general, dacă analitul țintă este un nucleofil (compus cu un exces de electroni), se selectează ca reactiv un electrofil (compuși cu deficit global de electroni) și viceversa. Reactivii trebuie să fie selectivi (să vizeze un site specific al moleculei), evitându-se astfel derivarea la mai multe site-uri din molecula țintă, metaboliți sau componente endogene. De exemplu, pentru o moleculă care conține atât grupe funcționale hidroxil, cât și amino, trebuie evitată utilizarea clorurilor de acid sau a anhidridele ca reactivi de derivitizare, deoarece acestea vor derivatiza ambele grupe funcționale. Dimpotrivă, utilizarea clorurii de dansil ca reactiv de derivitizare este adecvată pentru grupele funcționale amino și fenol, deoarece aceasta nu reacționează cu alcoolii alifatici. Alte cerințe care trebuie luate în considerare în selectarea reactivului includ disponibilitatea (în comerț), puritatea și costul. De obicei, costul reactivilor este minim și, prin urmare, nu reprezintă o barieră pentru utilizare.

Utilizând condiții optimizate, procedurile de derivatizare chimică sunt, de obicei, suficient de robuste pentru a fi aplicate pentru bioanaliză farmaceutică și sunt capabile să îndeplinească așteptările de reglementare. Acest lucru este demonstrat, de obicei, în timpul unui proces de validare riguros în care mai mulți parametri, inclusiv, dar fără a se limita la, acuratețea, precizia, selectivitatea, efectul de matrice etc. Selectarea standardului intern este esențială pentru a corecta orice posibilă pierdere de analit în timpul diferitelor etape de manipulare a probelor și de bioanaliză; asigurând astfel robustețea analizei. În cazul în care este posibil, trebuie utilizat un standard intern stabil cu deuteriu sau 13C, în caz contrar se poate înlocui cu un analog cu reactivitate, recuperare și proprietăți cromatografice similare. De asemenea, este imperativ să se ia în considerare și să se evalueze, atunci când este posibil, căile metabolice ale analitului de interes; trebuie evitată conversia metaboliților înapoi în molecula mamă în timpul procedurii de derivatizare, deoarece aceste procese implică adesea condiții dure (pH, căldură, perioade lungi de incubare etc.). Din nefericire, acest lucru poate fi complicat de lipsa standardelor de referință pentru metaboliți și de lipsa informațiilor metabolice la începutul ciclului de viață de dezvoltare a medicamentului din cauza strategiilor de dezvoltare diferențiată sau accelerată.

Derivatizarea chimică ca formă de artă

Utilizarea derivatizării chimice a scăzut în ultimii ani, deoarece noile tehnologii de separare au evoluat și au devenit mai obișnuite. Evoluția cromatografiei cu fluid supercritic (SFC), de exemplu, a deschis o nouă cale pentru analiza stereoisomerică chirală; reducând astfel necesitatea derivatizării chirale în anumite cazuri . Generații mai sensibile de instrumente de spectrometrie de masă cu triplu cuadripol cu tehnologii de ionizare noi sau îmbunătățite împing limitele de detecție la niveluri scăzute de picograme și, prin urmare, cererea de derivatizare chimică pentru a îmbunătăți sensibilitatea analizelor (prin îmbunătățirea ionizării sau a selectivității) a scăzut. Alte tehnologii, inclusiv UHPLC; micro-/nano-LC (pentru o mai bună eficiență a ionizării); instrumente TOF cu capacitate de mobilitate ionică (separare electronică, mai degrabă decât chimică/fizică) au contribuit, de asemenea, la declinul derivării chimice în laboratorul bioanalitic. Acestea fiind spuse, totuși, tehnica este încă aplicată pentru separări foarte complexe în cazul în care tehnologiile menționate mai sus nu pot avea un impact adecvat. Uneori, cuplarea derivatizării chimice cu una dintre aceste tehnologii are un impact sporit/additiv. În special, combinarea SFC cu derivatizarea chirală s-a dovedit a fi superioară pentru separarea chirală în comparație cu acea analiză SFC (date nesemnalate).

Din cauza acestui declin al tehnicii și a complexității sale în comparație cu alte tehnici analitice, derivatizarea chimică a evoluat într-o „formă de artă” de specialitate în laborator, care necesită abilități specializate combinate cu o competență puternică în domeniul chimiei. Ca urmare, tot mai puțini oameni de știință din mediile DMPK reușesc să stăpânească tehnica și să devină competenți în aplicarea acesteia. Întrebarea devine atunci cum să păstrăm aceste abilități și să le transmitem mai departe generațiilor viitoare de cercetători analitici. Ediții speciale ca aceasta, articole de recenzie, capitole de carte, ghiduri care conțin protocoale experimentale vor facilita și promova, sperăm, utilizarea derivatizării chimice ca mare instrument analitic.

Outline

Acest număr tematic acoperă progresele în tehnicile de derivatizare existente utilizate în cercetarea bioanalitică, precum și metode și abordări noi și inovatoare (de ex, combinarea derivatizării cu LC-MS cu microflux și ideea de noi tehnici de marcare chimică de către Niwa et al. ).

Ediția își propune să acopere aspecte legate de:

• Metode de derivatizare în bioanaliza LC-MS (inclusiv HPLC);

• Derivatizarea peptidelor pentru analiza proteinelor terapeutice;

• Reactivi de derivatizare chirali aplicați la probe biologice (vezi Vashistha et al. );

• Derivatizare pentru analiza compușilor endogeni (a se vedea „Beyond Classical Derivatization: Analyte ‘derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds’ de Barnaby et al. , sau ‘Derivatizarea steroizilor din probele biologice pentru analize GC-MS și LC-MS’ de Marcos et al. );

• Proceduri de derivatizare în controlul dopajului uman (a se vedea recenzia interesantă a lui Athanasiadou et al. ).

În timp ce este adevărat că derivatizarea chimică este doar un alt instrument în setul de instrumente bioanalitice, este un „must have” pentru un laborator DMPK și unul care va continua să aibă un impact în abordarea multor provocări bioanalitice.

Prin urmare, dacă nu vă place analitul dumneavoastră, schimbați-l (cu derivatizare chimică, adică)!

.