Degradarea asociată cu reticulul endoplasmatic (ERAD)

2.1 Procesul de pliere a proteinelor și recunoașterea proteinelor prost pliate

Aproximativ 30% din totalul proteinelor și toate proteinele transmembranare ale celulei sunt sintetizate în RE, care acționează ca un portal pentru intrarea în calea secretorie prin canalul Sec61 . Pe măsură ce este translocată, secvența semnal hidrofobă N terminală a proteinei nou sintetizate este scindată de un complex de peptidaze . Modificările co- și post-translaționale, cum ar fi formarea legăturilor disulfidice, etapele inițiale ale N-glicozilării și ancorarea în glicofosfatidilinositol (GPI) au loc în ER.

Mediul oxidant al ER ajută la formarea legăturilor disulfidice, care stabilizează structura terțiară a proteinei și facilitează asamblarea proteinei. În timpul procesului de pliere, legăturile disulfidice se formează prin oxidarea perechilor de tioli liberi de pe reziduurile de cisteină de către isomerazele disulfidice proteice (PDI). PDI-urile acționează ca niște cicluri, iar după oxidarea inițială, legăturile disulfidice sunt uneori izomerizate de PDI și ERp57, care este o tiol oxidoreductază, pentru a stabiliza plierea corectă a proteinei . Dimpotrivă, reducerea legăturilor disulfidice ale proteinelor prost împăturite este necesară pentru etapa de retrotranslocare a ERAD. Într-adevăr, PDI permite retrotranslocarea virusului simian virüs-40 (SV-40) și a toxinei holerice . ERdj5, o oxidoreductază ER, reduce legăturile disulfidice și interacționează cu EDEM (ER-degradation enhancing ER-degradation mannosidase-like protein) și, de asemenea, accelerează etapa de retrotranslocare a SV-40 . ERDJ5 reglează, de asemenea, degradarea variantei de α1-antitripsină cauzatoare de boală (null Hong Kong) .

Plasarea este ajutată de chaperonii moleculari care protejează împotriva formării și desfășurării greșite. Glicanii de tip chaperon se leagă de N-glicani jucând un rol crucial în plierea și degradarea proteinelor. Este evident că N-glicozilarea, controlul calității de pliere a proteinelor și ERAD sunt legate din punct de vedere funcțional. După ce intră în ER, o mare parte din lanțul polipeptidic nou sintetizat este glicozilat N-legat. Enzima oligozahariltransferază recunoaște secvența consensuală Asn-X-Ser/Thr în cea mai mare parte a moleculei proteice născute și integrează în mod covalent în proteină o grupare glicanică de bază cu conținut ridicat de mannoză (Glc3Man9GlcNAc2) din dolicolul localizat pe membrana ER. Din cauza timpului de înjumătățire foarte scurt al formei triglicozilate a oligozaharidelor legate de proteină, procesarea glicanilor începe imediat după transferul grupărilor glicanice precursoare prin intermediul enzimelor glucozidază. În urma scindării a două din cele trei resturi de glucoză, proteina rezultată ar putea interacționa cu lectine de control al calității precum CNX și CLR. Această interacțiune este păstrată până la scindarea reziduurilor de glucoză rămase. După eliberarea glicoproteinei din ciclul CNX/CLR, glucoza finală este, de asemenea, tăiată, creând un substrat neglicozilat. Acest lucru compromite interacțiunea substratului cu chaperonii lectinici. În acest stadiu, dacă proteina este pliată în mod corespunzător, ar putea ieși din ER pentru destinația lor finală. Cu toate acestea, dacă glicoproteina este încă desfășurată, este reținută în ER și reglucozilată de UDP-glucoză:glicoproteină glucosiltransferază și se reia cu CNX și CLR, oferind proteinei mai mult timp pentru o pliere adecvată. Nu se cunosc încă mecanismele implicate în terminarea ciclurilor de reglicozilare/deglicozilare. Cu toate acestea, este clar că, în cazul în care lanțul polipeptidic nu poate ajunge la forma sa matură după încercări repetate de pliere, reziduurile terminale de mannoză din lanțul glicanic central sunt eliminate treptat de către ER α1,2-mannosidază I (ERMan1). ERMan1 produce izomerul Man8GlcNAc2 prin eliminarea unui reziduu de mannoză din ramura centrală a N-glicanilor. Prin această tăiere, glicoproteinele devin substraturi mai slabe pentru reglicozilare și ieșirea din ciclul CNX .

Parchetele hidrofobe ale proteinelor corect pliate sunt, de obicei, îngropate în interiorul proteinelor solubile. Cu toate acestea, aceste patch-uri ar putea fi expuse în proteinele prost pliate. În cazul în care o proteină are suprafețe hidrofobe expuse, BiP se leagă de aceasta pentru a ascunde aceste suprafețe predispuse la agregare pentru încercările de pliere corectă, împiedicând agregarea. Cu toate acestea, în cazul în care plierea nu reușește sau întârzie, interacțiunea extinsă dintre chaperon și proteina falită servește pentru un proces sofisticat în care proteina este transferată către alți chaperoni și/sau către procesul ERAD .

Este bine acceptat faptul că primul pas al ERAD este selectarea proteinelor prost pliate de către chaperoni. Încă din 1999, s-a constatat că substraturile ERAD din drojdie diferă izbitor de mult în ceea ce privește cerința lor pentru Hsp70, BiP, care se află în ER-luminal . Degradarea substraturilor solubile, cum ar fi pαF și o formă mutantă a proteazei vacuolare carboxipeptidaza Y* (CPY*), depindea de BiP, în timp ce degradarea proteinelor transmembranare Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p și Hmg2p a avut loc într-un mod independent de BiP. În 2004, s-a demonstrat că substraturile cu domeniu citosolic, cum ar fi Ste6-166p, au fost degradate independent de BiP, în timp ce proteinele cu defecte luminale au necesitat BiP, ceea ce sugerează că, în funcție de topologia leziunii deformate (lumenul ER, membrana ER și citoplasma), chaperonii citosolici sau luminali funcționează în recunoașterea și direcționarea pentru degradare.

Este posibil să se studieze recunoașterea substratului în timpul ERAD folosind proteine model deformate. Este clar că de-mannozilarea este necesară pentru degradarea glicoproteinelor prost împăturite, deoarece inhibarea acestei garnituri de mannoză stabilizează glicoproteinele prost împăturite în ER . Supraexprimarea ERMan1 accelerează degradarea proteinelor N-glicozilate . Glicoproteina care conține Man8-GlcNAc2 rezultată în urma acestei tăieri devine un substrat pentru EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p în drojdie) – o lectină legată de mannosidază în ER. S-a propus, de asemenea, că glicoproteinele prost pliate interacționează cu ERManI și EDEM1 pentru ERD-ul lor, iar interacțiunea lectină-carbohidrați s-a dovedit a fi crucială pentru recunoașterea substratului EDEM. Deși s-a sugerat că ERMan1 este un cronometru biologic care inițiază ERAD a proteinelor prost pliate, studii recente au arătat că mannosidele nu sunt singurele responsabile pentru demannosilarea intensivă în timpul ERAD, în special în condiții non-basale. În condiții de stres ER (răspuns activ al proteinelor desfășurate), creșterea transcripțională a EDEM1 sporește eficiența ERAD prin suprimarea downreglementării proteolitice a ERMan1 . S-a dovedit că EDEM-urile joacă, de asemenea, un rol important în demannosilarea substraturilor . EDEM1 previne, de asemenea, reglicozilarea și promovează retrotranslocarea și degradarea unor substraturi ERAD . Pe de altă parte, în timp ce domeniul de homologie al mannosidazei (MHD) al Htm1p este necesar pentru legarea substratului, EDEM1 de mamifere leagă proteinele prost împăturite independent de domeniul MHD și, prin urmare, este posibil ca legarea substratului EDEM1 să nu necesite tăierea mannozei sau chiar glicozilarea. Astfel, în plus față de grupele de oligozaharide legate de N ale glicoproteinelor, EDEM1 poate recunoaște leziunile de pliere ale proteinelor prost pliate. Pe scurt, EDEM-urile sunt implicate direct sau indirect în demannosilarea glicoproteinelor și/sau servesc ca receptori care se leagă și țintesc proteinele tunse de mannoză pentru ERAD (Figura 1).

Truncționarea mannozei terminale din ramura C expune reziduurile de mannoză α terminale legate de α1,6 care funcționează ca un semnal de recunoaștere pentru lectinele ERAD, cum ar fi OS9 (Yos9 în drojdie) și XTP3-B (figura 2). Prin intermediul domeniului lor de homologie a receptorilor de mannoză-6-fosfat (MRH), ambele proteine recunosc în primul rând mannoza legată de α1,6 j. În plus, OS-9 recunoaște, de asemenea, mannoza legată de α1,6 e și c .

Diverse rapoarte sugerează că factorii (EDEMs, OS9 și XTP3-B) necesari pentru recunoașterea și direcționarea substratului rezidă în cadrul unor complexe supramoleculare și/sau interacționează cu regulatori importanți ai ERAD . De exemplu, EDEM1 interacționează cu CNX, primește substraturi din ciclul CNX și facilitează degradarea substratului ERAD, cum ar fi mutantul NHK-α1-antitripsină . EDEM1 se asociază, de asemenea, cu componentele mașinăriei de retrotranslocare ER. Se sugerează că EDEM1 se leagă de proteinele prost pliate și își folosește domeniul MHD pentru a direcționa proteinele aberante către glicoproteina SEL1L, glicoproteina rezidentă în ER a complexului ubiquitin ligază Hrd1-SEL1L . SEL1L schelează mai mulți factori de recunoaștere a substratului luminal și îi leagă de Hrd1. OS9 și XTP3-B se asociază, de asemenea, cu complexul Hrd1-SEL1L, care include, de asemenea, BiP și GRP94 . În plus, se propune ca XTP3-B să lege BiP de complexul Hrd1 . Conform unei ipoteze, acești trei chaperoni (EDEM1, OS9 și XTP3-B) funcționează ca oligomeri, în care un monomer interacționează cu substratul și altul cu complexul Hrd1-SEL1L . În plus, EDEM1 interacționează, de asemenea, cu Derlins, o proteină transmembranară, care este un candidat pentru translocon ; în plus, s-a demonstrat că Derlin2 îmbunătățește interacțiunea lui EDEM1 cu o AAA-ATPază citosolică p97, care cuplează hidroliza ATP cu retrotranslocarea proteinelor prost pliate .

Este clar că etapa de recunoaștere a substratului din ERAD este un mecanism complicat, în care sunt implicate mai multe enzime și chaperone diferite care au roluri distincte, dar concertate în ERAD. Mai mult, în funcție de substraturi, numărul și caracteristicile proteinelor implicate variază. De exemplu, au fost sugerate rolurile concertate ale EDEM, ERdj5 și BiP în degradarea proteinelor prost împăturite . După ieșirea din ciclul CNX-CLR, EDEM1 taie în continuare structura glicanică Man8-GlcNAc2, iar ERdj5 reduce legăturile disulfat. Concomitent, ERdj5 activează activitatea ATPază a BiP. BiP legată de ADP se leagă de proteina prost pliată și o menține într-o formă de componentă de retrotranslocare până când aceasta se transferă în complexul de retrotranslocare.

ERAD este, de asemenea, implicată în controlul calității proteinelor neglicozilate, care este independent de proteinele de tip lectină. Lanțul ușor al imunoglobulinei (Ig-K-LC), un substrat ERAD neglicozilat, este degradat într-o manieră dependentă de BiP. Okuda-Shimizu și Hendershot au caracterizat o cale ERAD pentru acest substrat BiP neglicozilat și diferite dinamici de interacțiune proteică care se pare că joacă un rol în acest proces. Ig-K-LC are două legături disulfidice intramoleculare, iar forma sa complet oxidată nu are capacitatea de a trece din ER în citoplasmă. BiP interacționează doar cu forma parțial oxidată a Ig, împiedicând oxidarea completă a Ig-K-LC și facilitând astfel eliberarea acesteia din ER . Mai mult, o proteină transmembranară care conține un domeniu UBL, proteina homoCys-responsivă rezidentă în ER (HERP), a fost implicată ca un receptor pentru substraturile BiP neglicozilate . HERP interacționează cu Derlin1, iar Ig-K-LC parțial oxidat este transferat de la BiP la complexul HERP-Derlin1-Hrd1 și ulterior direcționat către degradarea proteazomală . În afară de BiP, ERdj5, în calitate de disulfură reductază, este, de asemenea, indicat ca fiind important pentru ERAD a proteinelor neglicozilate . Substraturile neglicozilate capturate de BiP sunt transferate la ERdj5 pentru scindarea legăturilor disulfidice. Apoi, aceste substraturi sunt transferate la SEL1L cu ajutorul BiP pentru retrotranslocare. În afară de BiP, atât OS9, cât și XTP3-B au fost implicați în ERAD a proteinelor neglicozilate .

.