Cromatografia de filtrare pe gel

Aplicații ale cromatografiei de filtrare pe gel

Cromatografia de filtrare pe gel, un tip de cromatografie de excludere dimensională, poate fi utilizată fie pentru a fracționa moleculele și complexele dintr-o probă în fracțiuni cu un anumit interval de dimensiuni, fie pentru a elimina toate moleculele mai mari decât o anumită dimensiune din probă, fie o combinație a ambelor operații. Cromatografia de filtrare pe gel poate fi utilizată pentru a separa compuși precum moleculele mici, proteinele, complexele proteice, polizaharidele și acizii nucleici atunci când se află în soluție apoasă. Atunci când se utilizează un solvent organic ca fază mobilă, procesul se numește în schimb cromatografie cu permeabilitate în gel.

Cromatografia de filtrare pe gel poate fi utilizată, de asemenea, pentru:

• Fracționarea moleculelor și complexelor într-un interval de dimensiuni predeterminat
• Analiza și determinarea dimensiunilor
• Îndepărtarea proteinelor și complexelor mari
• Schimbarea tamponului
• Desalinizarea
• Îndepărtarea moleculelor mici, cum ar fi nucleotidele, amorsele, coloranții, și contaminanți
• Evaluarea purității probei
• Separarea radioizotopilor legați de cei nelegate

Mediile de cromatografie prin filtrare pe gel pentru toate utilizările de mai sus sunt disponibile sub formă de coloane preambalate cu flux gravitațional, coloane de centrifugare, coloane de cromatografie de joasă și medie presiune și rășini îmbuteliate.

Mecanismul cromatografiei prin filtrare pe gel

Într-o coloană de cromatografie prin filtrare pe gel, faza staționară este compusă dintr-o matrice poroasă, iar faza mobilă este tamponul care curge între bilele matricei. Sferele au un interval definit de mărime a porilor, cunoscut sub numele de interval de fracționare. Moleculele și complexele care sunt prea mari pentru a intra în pori rămân în faza mobilă și se deplasează prin coloană odată cu fluxul de tampon. Moleculele și complexele mai mici care sunt capabile să intre în pori intră în faza staționară și se deplasează prin coloana de filtrare pe gel printr-un traseu mai lung prin porii perlelor.

Care moleculă sau complex care se află peste intervalul de fracționare pentru o anumită coloană de cromatografie de filtrare pe gel se va deplasa prin coloană mai repede decât orice moleculă care poate intra în faza staționară. Prin urmare, orice constituent din probă care se află deasupra intervalului de fracționare va elua primul (în volumul gol) înaintea oricărui element care se află în intervalul de fracționare. Dimensiunea minimă care va rămâne în faza mobilă și nu va intra în faza staționară este cunoscută sub numele de limită de excludere. Bio-Rad oferă medii și coloane de cromatografie de filtrare pe gel cu limite de excludere care variază pe trei ordine de mărime, de la 100 daltoni la 100.000 daltoni (100 kDa).

Moleculele și complexele care pot intra în faza staționară vor fi fracționate în funcție de dimensiunile lor. Moleculele mai mici vor migra în profunzimea porilor și vor fi întârziate mai mult decât moleculele mai mari, care nu intră atât de ușor în pori, fiind astfel eluate mai repede din coloană. Această diferență de migrare a porilor duce la fracționarea componentelor în funcție de mărime, cele mai mari eluzionând primele.

În coloanele de cromatografie de filtrare pe gel concepute pentru desalinizare, schimb de tampoane și îndepărtarea moleculelor mici, cum ar fi nucleotidele, sărurile și compușii mici intră ușor în pori, sunt reținute și migrează mai lent prin coloană decât proteinele sau acizii nucleici mai mari. Prin urmare, componentele de interes din eșantion sunt eluate înaintea sărurilor, nucleotidelor etc. Trusele de curățare a ADN-ului care utilizează acest mecanism conțin adesea coloane de centrifugare prin filtrare pe gel.

Rezoluția, definită aici ca fiind claritatea limitelor dintre fracțiunile de mărime, este determinată de dimensiunea bilelor și de o serie de alți factori. Dimensiunea mai mică a bilelor produce, în general, o rezoluție mai mare într-o coloană cromatografică de filtrare pe gel. Moleculele compacte difuzează prin faza staționară mai repede decât moleculele liniare. Excluderea dimensională, intervalul de fracționare și viteza de eluție sunt afectate de compoziția tamponului, puterea ionică și pH-ul. Pentru fracționarea amestecurilor complexe de proteine, este posibil să fie necesară determinarea empirică a timpilor de eluție și a limitelor de excludere dimensională.

Mediu de cromatografie prin filtrare pe gel

Un criteriu important pentru mediile de cromatografie prin filtrare pe gel este ca mediile să fie inerte și ca nimic din probă sau din orice tampon să nu se lege de ele. Un alt aspect de luat în considerare este tipul de coloană de filtrare pe gel care se utilizează și dacă aceasta este utilizată într-un sistem de cromatografie presurizat sau în coloane de curgere gravitațională sau de centrifugare. Dacă se utilizează un sistem de cromatografie presurizat, atât coloana, cât și mediul trebuie să poată tolera presiunea și debitele utilizate.

Mediile utilizate în mod obișnuit pentru cromatografia de filtrare pe gel sunt bazate pe perle de agaroză sau poliacrilamidă, dextroză pentru sistemele de gravitație sau de joasă presiune și rășini polimerice pentru sistemele de presiune medie. Alegerea mediului depinde de proprietățile componentelor care urmează să fie separate și de alți factori experimentali. Următoarele sunt considerații generale pentru determinarea alegerii mediului de cromatografie prin filtrare pe gel:

• Intervalul de fracționare
• Limita de excludere a dimensiunilor
• Presiunea de operare
• Debitul
• Vâscozitatea probei
• Intervalul de pH
• Autoclavabilitate
• Toleranța la solvenți organici miscibili cu apa; unele probe pot fi mai solubile într-un amestec apă-organice
• Toleranță pentru detergenți, agenți haotopici, formamidă, etc.
• Temperatura de operare

Tipurile de probe, alegerea mediilor și configurația sistemului cromatografic vor determina ce parametri sunt cei mai importanți pentru o anumită aplicație de purificare.