Articles / septembrie 24, 2021

Criteriile histomorfologice ale măduvei osoase pot diagnostica cu acuratețe limfohistiocitoza hemofagocitară

Limfohistiocitoza hemofagocitară (HLH) este o tulburare inflamatorie multi-sistemică rară cu criterii de diagnostic bazate pe studiul HLH-2004. Hemofagocitoza este singurul criteriu histomorfologic, dar în mod izolat nu este nici specifică, nici sensibilă pentru diagnosticul de HLH. Deși au fost stabilite praguri obiective pentru criteriile clinice și de laborator, criteriile specifice pentru dovezile histomorfologice de hemofagocitoză în HLH nu au fost evaluate sau stabilite în mod riguros. Am încercat să determinăm dacă ar putea fi identificate criterii numerice și obiective pentru hemofagocitoza morfologică și dacă astfel de criterii ar ajuta la diagnosticarea HLH. Am analizat caracteristicile morfologice ale hemofagocitozei la 78 de pacienți care prezentau caracteristici clinice suspecte pentru HLH: 40 de pacienți cu HLH și 38 de pacienți fără HLH. Demonstrăm că eritrofagocitoza non-nucleată singură este o constatare nespecifică, în timp ce hemofagocitoza de granulocite , eritrocite nucleate (4 la 1000 de celule, AUC: 0,92, 95%CI: 0,87, 0,98), și cel puțin un hemofagocit care conține mai multe celule nucleate (AUC: 0,91, 95%CI: 0,85, 0,95) sunt puternic asociate cu HLH. Modelarea comună a hemofagocitelor care conțin granulocite înghițite, eritrocite nucleate și limfocite a distins în mod eficient între HLH și non-HLH (AUC validată încrucișat: 0,90, 95%CI: 0,83, 0,97).

Introducere

Limfohistiocitoza hemofagocitară (HLH) este un sindrom rar care pune în pericol viața și care apare secundar unei activări imune sistemice severe.1 Proliferarea celulelor T citotoxice duce la creșterea producției de citokine și la activarea macrofagelor rezidente tisulare. În cele din urmă, leziunile multi-sistemice ale organelor terminale cauzate de inflamația masivă pot duce la un rezultat fatal în lipsa unui diagnostic în timp util și a inițierii unei terapii adecvate.2

Limfohistiocitoza hemofagocitară afectează pacienți de toate vârstele și apare ca o boală ereditară sau secundar, în cadrul unor condiții predispozante care modifică răspunsul imunitar normal. Forma ereditară a bolii se prezintă în copilăria timpurie și este asociată cu mutații homozigote în gene implicate în imunitatea mediată de celulele T CD8 și de celulele NK.3 Aceste forme genetice de HLH sunt în mod uniform fatale fără transplant de celule hematopoietice sau terapie genică. HLH secundară poate apărea sporadic la indivizi sănătoși, dar este mai des întâlnită la pacienții cu tumori hematologice maligne, boli autoimune și imunosupresie iatrogenă. Practic, se consideră că toate cazurile necesită un factor declanșator infecțios sau neinfecțios pentru a iniția răspunsul imun aberant, indiferent de disfuncția imunitară subiacentă.74

Limfohistiocitoza hemofagocitară se prezintă brusc, pe o perioadă de câteva zile sau săptămâni, cu un tipar constant de febră, pancitopenie și splenomegalie. Anomaliile comune de laborator includ hiperferritinemie, hipofibrinogenemie, hipertrigliceridemie, receptorul IL-2 solubil ridicat și teste anormale ale funcției hepatice.1 Cele mai utilizate criterii de diagnostic pentru HLH au fost dezvoltate pentru includerea în studiul HLH-2004, care necesită dovezi genetice ale unei mutații asociate cu HLH sau îndeplinirea a 5 din cele 8 criterii clinice, inclusiv febră, splenomegalie, bicictopenie, hipertrigliceridemie sau hipofibrinogenemie, dovezi de hemofagocitoză în măduva osoasă sau în alte țesuturi, activitate scăzută sau absentă a celulelor NK, feritină crescută și receptorul IL-2 solubil ridicat.3 Deși nu au fost validate pentru adulți, aceste criterii HLH-2004 sunt aplicate pe scară largă la pacienții de toate vârstele.

Patologii joacă un rol critic în stabilirea diagnosticului pacienților suspectați de HLH. Examinarea măduvei osoase este efectuată pentru a evalua hemofagocitoza, a identifica malignitatea subiacentă și a exclude mimica benignă sau neoplazică. Prezența hemofagocitozei în măduva osoasă îndeplinește unul dintre criteriile de diagnostic ale HLH-2004; cu toate acestea, nu a fost stabilit niciun prag de diagnostic acceptat sau orientări de raportare. Lipsa unor orientări bazate pe dovezi conduce la o incertitudine considerabilă în rândul patologilor cu privire la gradul de hemofagocitoză care este suficient pentru a satisface acest criteriu. La această provocare se adaugă faptul că hemofagocitoza nu este specifică pentru diagnosticul de HLH în absența altor caracteristici clinice ale bolii. O eritrofagocitoză rară este frecvent întâlnită în aspiratele de măduvă osoasă, iar o hemofagocitoză crescută poate fi întâlnită în contextul sepsisului, al transfuziilor de sânge, al transplantului hematopoietic, al chimioterapiei și al sindromului mielodisplastic.118

Din cauza lipsei unui prag definit pentru îndeplinirea criteriului pentru diagnosticul de HLH, am conceput acest studiu retrospectiv pentru a interoga dacă caracteristicile morfologice cantitative sau calitative ale hemofagocitozei în aspiratele de măduvă osoasă sunt predictive pentru un eventual diagnostic de HLH. Am identificat o cohortă de pacienți care prezentau caracteristici clinice îngrijorătoare pentru HLH, iar aspiratele lor au fost examinate în orb.

Hemofagocitele au fost numărate la 1000 de celule nucleate în funcție de linia de proveniență a conținutului hematopoietic ingerat (figura 1). În plus față de caracteristicile cantitative, am evaluat o caracteristică morfologică binară, prezența mai multor celule nucleate în cadrul unui singur hemofagocit, ca o posibilă caracteristică predictivă a HLH.

Metode

Selecția pacienților

Am efectuat căutări în baza de date a Serviciului de Informații de Laborator de patologie (Powerpath) folosind următoarele cuvinte cheie: „hemophagocytic lymphohistiocytosis”, „hemophagocytosis”, „hemophagocytosis”, „erythrophagocytosis” și „HLH”. Această căutare a generat 258 de rezultate între datele 1 ianuarie 2013 și 7 ianuarie 2017 și a inclus text de oriunde din raportul de diagnosticare, inclusiv informațiile clinice furnizate, descrierea microscopică, linia de diagnosticare și/sau comentariul de diagnosticare (Figura 2). Dosarele medicale ale acestor pacienți au fost analizate de EG pentru a evalua dacă suspiciunea clinică pentru HLH era prezentă în momentul aspirației de măduvă osoasă, fie că era indicată pe formularul de solicitare a specimenului (de exemplu, „exclude HLH” sau „preocupare pentru HLH”), fie că era listată în diagnosticul diferențial din dosarul medical electronic (EMR) în decurs de o săptămână înainte de biopsie. Pentru fiecare pacient au fost colectate informații demografice, caracteristici clinice, impresii diagnostice, caracteristici patologice și valori de laborator la momentul biopsiei. Pacienții au fost clasificați ca „HLH” și „non-HLH” pe baza impresiilor de diagnostic ale hematologilor consultanți descrise în notele clinice. Diagnosticul final în toate cazurile a fost stabilit pe baza criteriilor HLH-2004, în combinație cu tabloul clinic general. Pacienții au fost excluși din analiză în cazul în care hemofagocitoza a fost observată întâmplător, independent de preocuparea clinică pentru HLH, lamelele nu au fost disponibile pentru examinare, HLH a fost luată în considerare, dar diagnosticul a fost echivoc în urma analizei, sau a fost observat un istoric documentat de tratament orientat spre HLH înainte de biopsie. Acest studiu a fost aprobat de consiliul de evaluare instituțională al Universității Stanford.

Evaluarea aspiratelor de măduvă osoasă

Apiratele de măduvă osoasă (colorate cu Wright-Giemsa) ale pacienților cu HLH și non-HLH au fost evaluate în orb. Fiecare lamă de aspirat a fost inițial examinată la putere mică (4x) pentru a identifica zonele cu hemofagocitoză și pentru a selecta o lamă adecvată pentru numărarea hemofagocitelor. Două sute cincizeci de celule nucleate intacte au fost numărate în fiecare cadran pe un singur aspirat pentru fiecare caz, în zonele cu cea mai mare densitate de hemofagocite. Histiocitele au fost numărate în funcție de descendența celulelor ingerate (hematii mature, nRBCS, granulocite și limfocite), iar suma celulelor progenitoare hematopoietice (HPC) a fost calculată ca număr total de histiocite care conțin celule hematopoietice ingerate. Prezența mai multor celule nucleate într-un singur hemofagocit a fost, de asemenea, notată.

Metodele utilizate pentru analiza statistică sunt descrise în Anexa suplimentară online.

Rezultate

Caracteristicile pacienților

Caracteristicile pacienților celor 40 de pacienți cu HLH și 38 de pacienți fără HLH sunt rezumate în tabelul 1. Nu au existat diferențe semnificative în ceea ce privește vârsta sau sexul. Pacienții cu HLH au avut o probabilitate mai mare de a prezenta o afecțiune malignă subiacentă în comparație cu grupul fără HLH (56% vs. 24%; P<0,05), limfomul difuz cu celule mari B (DLBCL) fiind cel mai frecvent diagnostic primar în rândul pacienților cu HLH (tabelele 1 și 2). Virusul Epstein-Barr (EBV) a fost cel mai frecvent factor declanșator infecțios identificat la pacienții cu HLH; 32,5% dintre pacienții din grupul HLH au avut dovezi de infecție cu EBV prin detectarea PCR în sângele periferic sau prin imunohistochimie, comparativ cu 10.5% în grupul non-HLH (P<0,01).

După cum era de așteptat, pacienții diagnosticați cu HLH au fost mai susceptibili de a prezenta constatări clinice și de laborator care să satisfacă fiecare dintre criteriile de diagnostic HLH-2004 (tabelul 1). S-au observat diferențe semnificative între grupurile HLH și non-HLH în ceea ce privește valoarea medie a fiecărui test de laborator (trigliceride, fibrinogen, feritină și IL-2r solubilă) și numărul de pacienți care satisfac fiecare criteriu individual HLH-2004, cu excepția funcției celulelor natural killer (NK). Deși testarea afectată sau absentă a funcției celulelor NK este considerată un instrument de screening valid pentru pacienții cu defecte genetice în citotoxicitate, acest test este rar comandat la adulții cu HLH secundară și are o rată mare de eșec, ceea ce îi limitează utilitatea diagnostică.

Hemofagocitoza a fost raportată în raportul diagnostic de măduvă osoasă la toți cei 40 de pacienți cu HLH, comparativ cu 12 din 38 (32%) în grupul non-HLH (P<0,01). Deși dovezile de hemofagocitoză pot fi liniștitoare pentru clinicieni în stabilirea diagnosticului de HLH, hemofagocitoza nu este necesară. În cohorta noastră, majoritatea pacienților diagnosticați în cele din urmă cu HLH (73%) au îndeplinit 5 sau mai multe criterii independent de dovezile de hemofagocitoză în aspiratul de măduvă osoasă (tabelul 1). Cu toate acestea, 9 pacienți (23 %) din grupul HLH și 8 pacienți (21 %) din grupul non-HLH au îndeplinit 4 criterii excluzând hemofagocitoza, ceea ce indică faptul că evaluarea morfologică a aspiratului de măduvă osoasă a fost esențială pentru diagnostic în cazul a 22 % dintre pacienții care prezentau caracteristici clinice îngrijorătoare pentru HLH.

Doi pacienți din grupul HLH au îndeplinit mai puțin de 5 dintre criteriile HLH-2004; cu toate acestea, ambii pacienți au fost asplectici din punct de vedere chirurgical, iar restul constatărilor clinice și de laborator, inclusiv prezența hemofagocitozei pe aspiratul de măduvă osoasă, au fost compatibile cu diagnosticul. Patru pacienți din grupul non-HLH au îndeplinit 5 criterii, dar nu au fost diagnosticați cu HLH. Notele clinice ale medicilor curanți indică faptul că cronicitatea simptomelor a fost considerată incompatibilă cu HLH. La niciunul dintre acești pacienți nu a fost identificată hemofagocitoză în măduva osoasă.

Dezvoltarea unor modele predictive pentru un diagnostic morfologic de limfoihistiocitoză hemofagocitară

Pacienții diagnosticați cu HLH (n=40) au prezentat valori semnificativ mai mari ale hemofagocitelor totale și ale hemofagocitelor cu oricare dintre liniile celulare (hematii, nRBC, granulocite și limfocite) în comparație cu pacienții fără HLH (n=38) (P<0.001 pentru toate neamurile) (figurile 1 și 3). Analiza de corelație a demonstrat că fiecare dintre criteriile clinice și de laborator incluse în criteriile HLH-2004 (cu excepția funcției NK) are o corelație pozitivă semnificativă cu numărul total de hemofagocite și hemofagocite cu fiecare dintre liniile celulare individuale, ceea ce indică faptul că gradul de hemofagocitoză se corelează cu diagnosticul de HLH (Online Supplementary Figure S1).

Independent unul de celălalt, fiecare linie genetică a distins destul de bine între HLH și non-HLH. NRBC ingerate și granulocitele ingerate au avut cea mai mare arie sub curbă (AUC), indicând un grad ridicat de clasificare corectă a subiecților HLH și non-HLH (AUC: 0,92), cu valori de prag de 2 celule ingerate și, respectiv, 1 celulă ingerată. Suma tuturor celor patru neamuri a avut, de asemenea, performanțe bune în ceea ce privește distincția între HLH și non-HLH, cu o valoare de prag de 6 (AUC: 0,92, 95%CI: 0,85, 0,98).

Dichotomizând fiecare neam pe baza valorilor de prag descrise mai sus și incluzându-le pe toate patru într-un arbore de decizie, hemofagocitele care ingerează granulocite au fost alese ca fiind cel mai important predictor al HLH, urmate de nRBC și limfocite (Figura 4A). Pacienții cu o absență a hemofagocitelor care ingerează granulocite au avut o șansă de 3% de a avea un diagnostic de HLH. Pacienții cu prezența a cel puțin un hemofagocit cu un granulocit ingerat, două sau mai multe hemofagocite cu nRBC ingerate și un hemofagocit cu limfocite ingerate împreună au fost garantați a avea un diagnostic de HLH (100% șanse). AUC validată încrucișat (CV) a acestui CART a fost de 0,90; 95%CI: 0,83-0,97.

Identificarea limfocitelor în cadrul HPC-urilor este rară, chiar și în prezența unei HLH floride. Cel mai mare număr de HPC care conținea limfocite a fost identificat la un pacient cu DLBCL și, pe baza morfologiei, a reprezentat probabil celule tumorale ingerate. În plus, distincția între eritrocite nucleate, limfocite și celule progenitoare hematopoietice în citoplasma unui histiocit este dificilă și supusă variabilității de interpretare. Ca atare, am creat un CART suplimentar care exclude limfocitele. Acest CART este identic cu primele două niveluri ale modelului anterior, pacienții având o șansă de 92% de a avea un diagnostic de HLH cu prezența a cel puțin un hemofagocit cu un granulocit ingerat și două sau mai multe hemofagocite cu nRBC ingerate (Figura 4B). În timp ce CV AUC a fost identică cu cea a primului, acuratețea generală a fost ușor mai mare în cazul CART fără limfocite (88% acuratețe CV vs. 86%).

Evaluare calitativă

Descrierea inițială a sindromului hemofagocitar asociat cu virusuri a descris histiocite care erau „umplute” cu elemente hematopoietice ingerate.11 Noi observăm frecvent fenomenul de celule nucleate multiple în interiorul histiocitelor individuale la pacienții cu HLH stabilită și am emis ipoteza că această constatare poate fi indicativă pentru o stare hemofagocitară patologică. Pentru a evalua semnificația gradului de hemofagocitoză în cadrul hemofagocitelor individuale, am analizat prezența celulelor nucleate multiple în cadrul histiocitelor (Figura 1). Analiza noastră a demonstrat în cele din urmă că cel puțin un hemofagocit care conținea celule nucleate multiple a fost identificat la 37 de pacienți cu HLH, în comparație cu doar 4 pacienți din grupul non-HLH (AUC: 0,91, 0,845-0,947), indicând că această caracteristică calitativă binară se comportă în mod similar cu parametrii cantitativi descriși mai sus pentru a distinge pacienții cu HLH de pacienții non-HLH (Tabelul 3).

Discuție

Datorită rarității diagnosticului și prezentării clinice nespecifice, HLH este un diagnostic dificil pentru clinicieni și patologi. Odată luată în considerare în diagnosticul diferențial, se urmărește în mod obișnuit un bilanț rapid care să includă evaluarea fiecăruia dintre criteriile HLH-2004, deoarece intervenția terapeutică timpurie îmbunătățește rezultatele la acești pacienți adesea în stare critică. Din nefericire, nu există un prag definit pentru a satisface criteriul de diagnostic al hemofagocitozei în măduva osoasă și nu au fost stabilite orientări bazate pe dovezi pentru raportarea constatărilor.

În acest scop, am conceput acest studiu retrospectiv pentru a determina dacă caracteristicile cantitative ale hemofagocitozei în momentul evaluării inițiale a măduvei osoase sunt predictive pentru diagnosticul final de HLH la pacienții care prezintă caracteristici clinice îngrijorătoare pentru acest diagnostic. Având în vedere că HLH se prezintă în mod clasic cu citopenie multilineală despre care se crede că este rezultatul consumului de celule hematopoietice de către macrofagele activate,12 am suspectat că pacienții cu HLH ar fi mai susceptibili de a prezenta hemofagocitoză a eritrocitelor nucleate, a granulocitelor și a limfocitelor în comparație cu pacienții fără HLH. În plus față de evaluarea posibilelor diferențe cantitative în hemofagocitoză, am evaluat simultan prezența mai multor celule nucleate în cadrul unui singur hemofagocit ca o caracteristică morfologică binară candidată care poate diferenția pacienții cu hemofagocitoză patologică.

În general, am constatat că pacienții cu HLH au prezentat un număr semnificativ mai mare de HPC-uri de către fiecare dintre liniile examinate (Tabelul 3). Am identificat, de asemenea, treisferturi cantitative care pot fi utilizate pentru a diagnostica cu exactitate majoritatea cazurilor de HLH: un granulocit sau două celule eritroide nucleate la 1000 de celule nucleate. În plus, am utilizat analiza arborelui de clasificare și de regresie pentru a identifica cea mai bună combinație de variabile pentru a crea un model și mai specific și mai predictiv pentru discriminarea pacienților cu HLH. În cele din urmă, am arătat că prezența mai multor celule nucleate în cadrul unui singur hemofagocit a fost, în plus, predictivă pentru diagnosticul de HLH în rândul pacienților care prezentau constatări clinice îngrijorătoare pentru această boală.

Descrierea inițială a sindromului hemofagocitar asociat cu virusuri (VAHS) a descris hemofagocitoza floridă în 19 cazuri de pacienți imunodeprimați și anterior sănătoși care prezentau caracteristici clinice compatibile cu HLH.11 În 60 de aspirate consecutive de măduvă osoasă folosite pentru comparație, ei au găsit eritrofagocitoză în 29 din 60 de cazuri; cu toate acestea, gradul de fagocitoză nu a fost „niciodată de un grad care să poată fi confundat cu cel al VAHS”. Acest studiu efectuat înainte de elaborarea criteriilor HLH-2004 a furnizat dovezile inițiale ale asocierii hemofagocitozei cu VAHS (ceea ce acum am numi HLH) și a arătat că descoperirea eritrofagocitozei este frecvent identificată în aspiratele de măduvă osoasă ale pacienților fără HLH, demonstrând o lipsă de specificitate în izolarea constatărilor clinice.

Am efectuat o evaluare similară, fără orbire, a 87 de aspirate de măduvă osoasă de la pacienți cu malignități mieloide și limfoide de novo și post-tratament, citopenii benigne, și măduve cu stadializare negativă, și am identificat predominant eritrofagocitoza eritrocitelor mature în 39% din aceste cazuri. Aplicând la acest set de date pragul cantitativ determinat în urma analizei noastre pentru eritrocitele înghițite și nenucleate (eritrofagocite), am constatat că doar 3 dintre cei 87 de pacienți (5%) ar satisface acest criteriu morfologic (4 la 1000 de celule). În mod similar, dacă aplicăm pragul cantitativ pentru granulocite (1 la 1000 de celule), doar 4 din cei 87 de pacienți (4%) ar satisface acest criteriu morfologic. Prin urmare, deși putem găsi într-adevăr exemple rare de eritrofagocitoză în frotiurile de aspirat ale unei mari minorități de cazuri, aplicarea pragurilor cantitative relevă o incidență scăzută a hemofagocitozei semnificative din punct de vedere clinic într-o populație de pacienți care îi reflectă pe cei observați în practica diagnostică de rutină.

Un studiu recent realizat de Ho et al. a examinat specificitatea hemofagocitozei pentru HLH prin cuantificarea cantității absolute de hemofagocitoză identificată în aspiratele de măduvă osoasă ale pacienților al căror raport de patologie diagnostică descria hemofagocitoza.10 Aceștia au demonstrat că prezența hemofagocitozei, chiar și atunci când este prezentă într-o cantitate mare, nu are specificitate pentru HLH. Experiența noastră instituțională este în concordanță cu concluzia lor conform căreia o hemofagocitoză semnificativă nu este predictivă pentru diagnosticul de HHL în absența unor caracteristici clinice care să fie îngrijorătoare pentru această boală; cu toate acestea, prezența unei hemofagocitoze substanțiale este o constatare relativ rară. Hemofagocitoza incidentală a fost raportată în 86 din 8097 (1,1%) rapoarte interne de biopsie a măduvei osoase la Spitalul Universitar Stanford în perioada 2013-2017. Majoritatea rapoartelor indică o hemofagocitoză „rară” (61%), în timp ce restul descriu o hemofagocitoză „împrăștiată”, „ocazională” sau „vioaie”. Un subset (n=12) din aceste din urmă cazuri a fost analizat. Toate cele 12 cazuri au demonstrat eritrofagocitoză. Jumătate dintre cazuri prezintă granulocite ingerate și 3 cazuri au demonstrat multiple celule nucleate în cadrul HPC-urilor individuale. Niciunul dintre acești pacienți nu a fost diagnosticat în cele din urmă cu HLH.

O limitare majoră a acestui studiu este natura sa retrospectivă. Populația noastră este limitată la pacienții la care diagnosticul clinic a fost evaluat în profunzime și s-a făcut o determinare definitivă cu privire la diagnosticul de HLH. Am exclus pacienții la care diagnosticul definitiv a fost ambiguu. În plus, deși cohorta noastră include toți pacienții de la instituția noastră care au îndeplinit criteriile de evaluare, inclusiv copii, doar un singur pacient din cohorta noastră a avut o mutație homozigotă care a diagnosticat HLH primară, ceea ce limitează aplicabilitatea constatărilor noastre la pacienții cu forme genetice ale bolii. În cele din urmă, observăm că, în timp ce testarea CD107a a fost descrisă ca un test mai sensibil pentru HLH primară,13 acest test dezvoltat recent nu a fost utilizat în această cohortă retrospectivă.

În cele din urmă, diagnosticul de HLH se bazează pe evaluarea amănunțită a pacienților în contextul clinic adecvat. În mod similar, examinarea microscopică a frotiurilor de aspirat de măduvă osoasă la pacienții suspectați de HLH necesită o evaluare atentă a prezenței hemofagocitozei. Rezultatele noastre demonstrează că pragurile cantitative ale liniei de proveniență a celulelor ingerate, fie singure, fie în combinație, prezic cu exactitate eventualul diagnostic de HLH. În plus, demonstrăm că identificarea unui singur hemofagocit care conține mai multe celule hematopoietice nucleate în citoplasma sa are rezultate similare cu abordarea noastră cantitativă. Cu o validare externă și un studiu prospectiv suplimentar, sperăm că aceste date vor ajuta la furnizarea unei metode pentru ca patologii și medicii să evalueze sistematic și să clasifice cu exactitate pacienții cu HLH și să contribuie la stabilirea unor linii directoare consensuale de diagnosticare și raportare.

Footnotes

↵* BAM și RSO au contribuit în mod egal la această lucrare.
Verificați versiunea online pentru cele mai actualizate informații despre acest articol, suplimentele online și informații despre dezvăluirile autorilor &: www.haematologica.org/content/103/10/1635

Recepționat la 17 decembrie 2017.
Acceptat la 13 iunie 2018.

Universe