Clinical Significance of Cannabinoid Receptors CB1 and CB2 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions

Abstract

Sistemul endocannabinoid este alcătuit din receptori canabinoizi (CB1 și CB2), liganzii lor endogeni (endocannabinoizi) și proteinele responsabile de metabolismul acestora participă la numeroase funcții diferite, indispensabile reglării homeostatice în mai multe țesuturi, exercitând și efecte antitumorigene. Studiul de față a avut ca scop evaluarea semnificației clinice a expresiei CB1 și CB2 în leziunile tiroidiene umane benigne și maligne. Expresia proteinelor CB1 și CB2 a fost evaluată imunohistochimic pe țesuturi tiroidiene incluse în parafină obținute de la 87 de pacienți cu leziuni benigne și maligne și a fost analizată statistic cu parametrii clinico-patologici, capacitatea proliferativă a celulelor foliculare și rata de risc de recidivă estimată conform sistemului de stadializare al Asociației Americane de Tiroidă (ATA). Expresia CB1 și CB2 îmbunătățită a fost semnificativ mai frecvent observată în leziunile tiroidiene maligne comparativ cu cele benigne ( și , respectiv ). Expresia CB1 și CB2 îmbunătățită a fost, de asemenea, semnificativ mai frecvent observată în cazul carcinoamelor papilare în comparație cu nodulii hiperplastici ( și , resp.). În cazul leziunilor tiroidiene maligne, expresia CB2 crescută a fost asociată în mod semnificativ cu prezența metastazelor ganglionare limfatice . Expresia crescută a CB2 a fost, de asemenea, mai frecvent observată în cazurile de tiroidă malignă cu prezența invaziei capsulare , limfatice și vasculare , precum și în cele cu risc crescut de rată de recidivă , la un nivel nesemnificativ însă, în timp ce expresia CB1 nu a fost asociată cu niciunul dintre parametrii clinicopatologici examinați. Datele noastre sugerează că receptorii CB pot fi implicați în transformarea malignă a tiroidei și în special receptorul CB2 ar putea servi ca biomarker util și țintă terapeutică potențială în neoplazia tiroidiană.

1. Introducere

Sistemul endocannabinoid (ECS) este un sistem endogen de inducere a semnalelor lipidice, prezent în diferite țesuturi umane, care exercită multe funcții diferite și fără legătură între ele. Studii substanțiale au indicat efectele reglatoare ale ECS asupra sistemului nervos central și periferic, a tractului gastrointestinal și a sistemului imunitar, fiind implicat în multiple procese, cum ar fi motilitatea gastrointestinală, starea de spirit, reglarea durerii, memoria și pofta de mâncare . Aceste funcții sunt declanșate de legarea liganzilor endogeni și exogeni la receptorii canabinoizi (receptorii CB). Pe lângă aceste funcții bine cunoscute, ECS exercită, de asemenea, efecte antiproliferative prin modularea mai multor căi de semnalizare , în timp ce activarea sa poate avea o semnificație prognostică pentru progresia dezvoltării tumorale .

Există două subtipuri de receptori CB, cu distribuție diferită între țesuturile umane. Receptorul CB1 este localizat în principal la nivelul sistemului nervos central, adipocitelor, ficatului, pancreasului, mușchilor scheletici și limfocitelor T . Receptorul CB2 este detectat în principal în celulele imune, dar și în neuroni și în alte celule care alcătuiesc sistemul nervos central, cum ar fi astrocitele și microglia, precum și în celulele endoteliale cerebromicrovasculare . Activarea receptorilor CB inhibă formarea de AMPc prin cuplarea sa cu proteinele Gi, ceea ce duce la scăderea fosforilării dependente de proteina kinaza A (PKA-) . Receptorii CB se cuplează, de asemenea, la kinaza reglată de semnalul extracelular (ERK) și în mod specific la p42/p44 și p38 , participând la semnalizarea fosfatidilinositol-3-kinazei (PI3K) și a ceramidei . Alți receptori sunt, de asemenea, atașați la ECS, cum ar fi canalul de cationi cu potențial receptor tranzitoriu din subfamilia V, membrul 1 (TRPV-1), receptorii activați de proliferatorul peroxisomului (PPAR) și receptorii cuplați cu proteina G non-CB1/CB2 GPR55 .

Liganzii ECS sunt canabinoizii, inclusiv componentele bioactive ale Cannabis Sativa, compușii sintetici CB-mimetici și liganzii endogeni ai receptorilor CB . Cea mai importantă moleculă din prima categorie este Δ9-THC, care este bine cunoscută pentru trăsăturile sale psihoactive . Celelalte două categorii includ liganzii sintetici care au fost dezvoltați în prezent (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiol, acid ajulemic, WIN55,212-2) și endocannabinoizii care sunt produși de organismul uman și sunt mesageri lipidici derivați ai acidului arahidonic (AA) conjugat fie cu etanolamina, fie cu glicerolul . Cele mai importante dintre aceste molecule sunt anandamida (AEA) și 2-arachidonoilglicerolul (2-AG), dar au fost identificate și alte substanțe, cum ar fi O-arachidonoiletanolamina (OAE, virodhamina), 2-arachidonoilglicerolul eter (2-AGE, noladin eter), N-arachidonoildopamina (NADA) și palmitoiletanolamida (PEA) . În afară de receptorii CB și de toți liganzii lor, ECS include, de asemenea, enzimele esențiale pentru biosinteza, transportul și degradarea liganzilor .

În plus față de funcțiile ECS în vederea menținerii homeostaziei, interacțiunea încrucișată menționată mai sus dintre ECS și cele mai importante căi oncogene (calea MAPK/ERK și PI3K/Akt) a câștigat recent interes și a evidențiat importanța ECS în tumorigeneză . În plus, s-a demonstrat că canabinoizii induc apoptoza în celulele canceroase, inhibă vascularizarea tumorală prin scăderea VEGF și suprimă capacitatea de invazie a celulelor canceroase . Efectele antiproliferative prevalează și mai multe studii sugerează că canabinoizii au potențial ca agenți antitumorali .

Diagnosticarea leziunilor tiroidiene a crescut recent, nu numai datorită tehnicilor de diagnostic îmbunătățite, ci și datorită creșterii incidenței lor reale în populație . De fapt, carcinomul tiroidian este cea mai frecventă afecțiune malignă a sistemului endocrin . Deși cancerul tiroidian este, de obicei, complet vindecat prin intervenție chirurgicală și terapie, 10-20% dintre pacienți încă mor din cauza recidivei sau a progresiei tumorii . Prin urmare, este esențial să se stabilească noi strategii de tratament și să se găsească noi markeri de prognostic pentru a prezice evoluția clinică pentru fiecare pacient și pentru a personaliza în consecință modalitățile terapeutice disponibile. În acest aspect, studiul de față și-a propus să evalueze expresia imunohistochimică a receptorilor CB1 și CB2 în leziunile tiroidiene benigne și maligne în asociere cu caracteristicile clinico-patologice legate de prognostic.

2. Pacienți și metode

2.1. Pacienți și metode

2.1. Pacienți

Materialul examinat a constat din 87 de probe chirurgicale tiroidiene examinate histologic de la un număr egal de pacienți care au fost supuși unei intervenții chirurgicale tiroidiene pentru leziuni benigne și maligne. În studiu au fost incluse 43 de cazuri benigne (37 de noduli hiperplastici și 6 tiroidite Hashimoto) și 44 de cazuri maligne (40 de carcinoame papilare și 4 foliculare). Fiecare neoplasm a fost clasificat în conformitate cu clasificarea histologică OMS a tumorilor tiroidiene . Riscul de recidivă a fost estimat în conformitate cu sistemul de stadializare al American Thyroid Association (ATA) . Niciunul dintre pacienți nu a primit vreun fel de tratament anticanceros înainte de intervenția chirurgicală și nu au existat antecedente clinice de iradiere a capului și gâtului sau de alte tipuri de cancer.

2.2. Imunohistochimie

Imunochimia pentru CB1 și CB2 a fost efectuată pe secțiuni de țesut tiroidian fixate în formol și incluse în parafină, utilizând un anticorp policlonal CB1 IgG de capră (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) și un anticorp policlonal CB2 IgG de iepure (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). Pe scurt, secțiunile de țesut de 4 μm grosime au fost deparafinate în xilen și au fost aduse la apă prin alcooli gradați. Recuperarea antigenului a fost realizată prin microundele lamelelor în tampon citrat 10 mM (pH 6,1) timp de 15 minute (min) la putere mare, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pentru a elimina activitatea peroxidazei endogene, secțiunile au fost apoi tratate cu peroxid de hidrogen 0,3 % în metanol proaspăt preparat, la întuneric, timp de 30 de minute, la temperatura camerei. Legarea nespecifică a anticorpilor a fost blocată cu Eraser și Sniper, reactivi de blocare specifici pentru anticorpii primari de capră și, respectiv, de iepure (Biocare Medical, Concord, California, SUA), timp de 5 minute. Secțiunile au fost incubate timp de 1 oră (h), la temperatura camerei, cu anticorpii primari împotriva CB1 și CB2, diluați 1 : 300 și, respectiv, 1 : 200, în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Secțiunile au fost apoi incubate la temperatura camerei cu reactiv de legare biotinilat (Biocare Medical) timp de 10 min, urmat de incubarea cu marker de streptavidină conjugat cu peroxidază (Biocare Medical) timp de 10 min. Activitatea imună peroxidazică rezultată a fost dezvoltată cu ajutorul unui kit de substrat DAB (Vector Laboratories, California, SUA) timp de 10 min. Secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină Harris’ și montate în Entellan (Merck, Darmstadt, Germania). S-au efectuat controale negative corespunzătoare prin omiterea anticorpului primar și/sau înlocuirea acestuia cu un antiserum irelevant. Ca și control pozitiv, s-au folosit secțiuni de țesut de carcinom cu celule scuamoase de sân și de limbă mobilă cu expresie cunoscută a CB1 și CB2. Capacitatea proliferativă a celulelor foliculare a fost evaluată prin expresia imunohistochimică Ki-67, așa cum a fost descrisă anterior .

2.3. Evaluarea imunohistochimică

Evaluarea imunohistochimică a fost realizată prin numărarea a cel puțin 1000 de celule tumorale în fiecare caz de către doi observatori independenți (Stamatios Theocharis și Paraskevi Alexandrou), orbiți la datele clinice, cu un acord complet al observatorilor. Specimenele au fost considerate „pozitive” pentru CB1 și CB2 atunci când mai mult de 5% din celulele tumorale din cadrul secțiunii au fost colorate pozitiv . Imunoreactivitatea celulelor tumorale pentru CB1 și CB2 a fost notată în funcție de procentul de celule tumorale CB1 și CB2 pozitive, astfel: 0: colorare negativă – 0-4% din celulele tumorale pozitive; 1: 5-24% din celulele tumorale pozitive; 2: 25-49% din celulele tumorale pozitive; 3: 50-100% din celulele tumorale pozitive, iar intensitatea acesteia a fost notată ca 0: colorare negativă, 1: colorare ușoară; 2: colorare intermediară; 3: colorare intensă . În cele din urmă, expresia CB1 și CB2 a fost clasificată ca fiind scăzută, dacă scorul total a fost 0 sau 2 și ridicată și dacă scorul total a fost ≥3 . Imunoreactivitatea Ki-67 a fost clasificată în funcție de procentul de celule foliculare colorate pozitiv a depășit valoarea procentuală mediană în două categorii (sub și peste valoarea medie), așa cum s-a raportat anterior .

2.4. Analiză statistică

Testele Chi-pătrat au fost utilizate pentru a evalua diferența de expresie CB1 și CB2 între leziunile tiroidiene maligne și benigne, precum și între cazurile de carcinom papilar și noduli hiperplastici. S-au aplicat teste Chi-pătrat pentru a evalua asocierile dintre expresia CB1 și CB2 și caracteristicile clinico-patologice în subgrupul de pacienți cu leziuni tiroidiene maligne. A fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic cea cu două cozi. Analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul pachetului software SPSS pentru Windows (versiunea 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, SUA).

3. Rezultate

3.1. Semnificația clinică a expresiei CB1 în leziunile tiroidiene umane maligne și benigne

Posibilitatea CB1 (scor IHC > 0) a fost observată în 52 (60%) din 87 de leziuni tiroidiene. Treizeci și unu (36%) din cele 87 de cazuri examinate au prezentat o imunoreactivitate CB1 ridicată (scor IHC ≥ 3). Modelul subcelular de distribuție a CB1 a fost predominant citoplasmatic și ocazional membranos. Zonele înconjurătoare normale adiacente tumorii s-au dovedit a fi negative pentru CB1. În figurile 1(a) și, respectiv, 1(b) sunt ilustrate imunocolorări CB1 reprezentative pentru nodulul hiperplastic și carcinomul papilar. Imunoreactivitatea CB1 a fost semnificativ diferită între leziunile tiroidiene benigne și maligne (tabelul 1, ). Expresia ridicată a CB1 a fost semnificativ mai frecvent observată în carcinomul papilar în comparație cu nodulii hiperplastici (Tabelul 1, ). Expresia CB1 nu a fost asociată cu vârsta și sexul pacienților și cu capacitatea proliferativă a celulelor foliculare. În subgrupul de leziuni maligne ale tiroidei, expresia ridicată a CB1 a fost observată în 23 (52%) din 44 de cazuri. Nu a existat nicio asociere între expresia receptorului CB1 și dimensiunea tumorii, prezența invaziei capsulare, vasculare sau limfatice, a metastazelor ganglionare și a capacității de proliferare a celulelor foliculare (tabelul 2). Expresia receptorului CB1 nu a fost asociată cu riscul de recidivă estimat în conformitate cu sistemul de stadializare ATA (datele nu sunt prezentate).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Semnificația clinică a expresiei CB2 în leziunile tiroidiene umane maligne și benigne

Posibilitatea CB2 (scor IHC > 0) a fost observată în 61 (71%) din cele 87 de leziuni tiroidiene. Treizeci și două (37%) din cele 87 de cazuri examinate au prezentat o imunoreactivitate CB2 ridicată (scor IHC ≥ 3). Modelul subcelular de distribuție a fost predominant citoplasmatic și ocazional membranos. Zonele înconjurătoare normale adiacente tumorii au fost găsite negative pentru CB2. În figurile 1(c) și, respectiv, 1(d) sunt ilustrate imunocolorări CB2 reprezentative pentru noduli hiperplastici și carcinom papilar. Expresia ridicată a CB2 a fost semnificativ mai frecvent observată în leziunile maligne ale tiroidei în comparație cu cele benigne, precum și în carcinomul papilar în comparație cu nodulii hiperplazici (tabelul 1 și , respectiv ). În subgrupul de leziuni tiroidiene maligne, expresia ridicată a CB2 a fost observată în 24 (55%) din 44 de cazuri. Expresia ridicată a CB2 a fost asociată în mod semnificativ cu prezența metastazelor la nivelul ganglionilor limfatici (Tabelul 2, ). Expresia ridicată a CB2 a fost, de asemenea, asociată cu prezența invaziei capsulare, a invaziei limfatice și a invaziei vasculare, la un nivel nesemnificativ însă (Tabelul 2, , , și , , respectiv). Nu au fost observate asocieri între expresia CB2 și vârsta și sexul pacienților, dimensiunea tumorii și rata proliferativă a celulelor foliculare (Tabelul 2). Expresia ridicată a receptorilor CB2 a fost observată mai frecvent în leziunile tiroidiene maligne care prezintă un risc crescut de rată de recidivă conform sistemului de stadializare ATA, la un nivel nesemnificativ totuși ().

4. Discuție

În studiul de față, expresia proteinelor CB1 și CB2 a fost crescută în leziunile tiroidiene maligne comparativ cu cele benigne. De asemenea, descriem pentru prima dată o asociere între expresia proteinei CB2 și parametrii clinicopatologici cruciali pentru managementul și prognosticul pacienților. În special, expresia CB2 crescută a fost asociată în mod semnificativ cu prezența metastazelor ganglionare și la limită cu prezența invaziei vasculare, în timp ce au fost observate, de asemenea, asocieri indicative, dar nesemnificative, cu prezența invaziei capsulare și limfatice și cu rata estimată de recidivă. S-au obținut rezultate similare pentru supraexpresia receptorului CB1, în ceea ce privește leziunile maligne în comparație cu cele benigne ale tiroidei; cu toate acestea, a fost observată o asociere nesemnificativă sau o tendință de corelație între expresia CB1 și parametrii clinico-patologici.

În conformitate cu constatările prezente, receptorii CB au fost suprareglați în anumite tumori umane maligne, inclusiv carcinomul oral cu celule scuamoase, carcinomul pancreatic, hepatocelular și prostatic, în timp ce nu au fost exprimați în țesuturile normale ale acestor organe . Pe de altă parte, receptorul CB1 a fost reglat negativ în carcinomul colorectal, spre deosebire de țesuturile normale adiacente, ceea ce evidențiază rolurile diferite ale ECS în diferite tumori și indică interacțiunile multiple dintre ECS și mecanismele care controlează creșterea și proliferarea celulară . Aceste mecanisme pot include inducerea directă a morții celulelor transformate, oprirea ciclului celular și inhibarea angiogenezei tumorale și a metastazelor . Efectele antitumorale ale ECS au fost, de asemenea, descrise în numeroase studii. În cazul cancerului colorectal, endocanabinoizii și canabinoizii sintetici au fost capabili să inducă apoptoza și să inhibe carcinogeneza prin mecanisme care implică atât receptorii CB, cât și canalele TRPV1 și calea PPARγ . Rezultate similare au fost obținute în studiile efectuate asupra cancerului pancreatic, pulmonar și mamar, colangiocarcinomului și carcinomului hepatocelular . Au fost raportate, de asemenea, efecte sinergice ale canabinoizilor cu chimioterapia antitumorală convențională .

Supraexpresia receptorilor CB în carcinomul tiroidian a fost raportată recent, in vitro . Mai exact, stimularea IL-12 a liniilor celulare de carcinom tiroidian anaplazic a indus supraexprimarea receptorului CB2 și a condus la apoptoza mediată de CB2-agonist și la regresia tumorală . Mai mult, suprareglarea CB2 a făcut ca celulele tumorale să devină mai sensibile la tratamentul cu chimioterapie standard . O explicație presupusă pentru acest fenomen a fost activarea dependentă de ceramidă a căii mitocondriale intrinseci, care duce la apoptoză, fiind declanșată de activarea receptorului CB2 . Un alt studiu efectuat pe linii celulare de carcinom tiroidian a arătat că 2-metil-2′-F-anandamida (Met-F-AEA) a inhibat creșterea tumorală, asociată cu niveluri ridicate ale receptorilor CB1 . Expresia abundentă a receptorului CB1 a fost observată în liniile celulare mai receptive la tratament, care ulterior au fost mai sensibile la inhibarea creșterii. Astfel de rezultate au fost atribuite activării, creșterii p53 și scăderii ciclinei A, ceea ce a condus la apoptoză .

Pe lângă posibilele implicații terapeutice în ceea ce privește tumorigeneza și ECS, detectarea supraexpresiei receptorilor CB poate avea potențial ca indicatori de prognostic. Suprareglarea ambilor receptori CB în probele de țesut de carcinom hepatocelular a fost asociată în mod semnificativ cu un prognostic îmbunătățit și o supraviețuire fără boală mai lungă . Aceste constatări au fost combinate cu caracteristicile histopatologice ale tumorii, deoarece nivelurile ridicate ale receptorilor CB au fost observate în cazurile care prezentau o bună diferențiere și o implicare limitată a tractului portal . Pe de altă parte, imunoreactivitatea CB2 a fost asociată cu o supraviețuire fără boală mai scurtă în cazul carcinomului cu celule scuamoase la nivelul capului și gâtului . În ceea ce privește receptorul CB1, supraexpresia acestuia a fost asociată cu un rezultat slab al pacienților în cazul carcinomului colorectal, prostatic și pancreatic . În special, expresia crescută a CB1 la pacienții cu carcinom colorectal în stadiul IV a fost corelată în mod independent cu un prognostic negativ. Expresia crescută a CB1 a fost, de asemenea, asociată cu adenocarcinomul prostatic agresiv care prezintă un scor Gleason mai mare, o dimensiune mai mare a tumorii și o rată crescută de proliferare celulară, precum și metastaze la diagnosticare . Mai mult, o expresie scăzută a CB1 sau niveluri ridicate de FAAH/MAGL au fost corelate cu o rată de supraviețuire mai mare și cu o stare de durere mai mare. S-au observat rezultate similare, dar nesemnificative din punct de vedere statistic, pentru receptorul CB2 . Ținând cont de datele menționate mai sus, studiile disponibile în prezent privind nivelurile de receptori CB și asocierile acestora cu prognosticul în diferite tumori par contradictorii și pot fi strâns legate de gradul de participare a ECS în geneza tumorală.

5. Concluzie

Nivelurile crescute de expresie imunohistochimică a receptorilor CB1 și CB2 au fost corelate cu malignitatea glandei tiroide. Mai mult, nivelurile crescute de expresie CB2 au fost asociate cu caracteristici clinicopatologice importante pentru managementul terapeutic al pacienților. Aceste rezultate au susținut dovezile că receptorii CB și în special receptorul CB2 pot interfera cu căile moleculare care participă la transformarea malignă a tiroidei și ar putea fi considerați ca potențiale ținte terapeutice pentru a suprima progresia tumorală. Studii de cohortă mai mari sunt puternic recomandate pentru a confirma și stabili utilitatea clinică a receptorilor CB ca potențiali markeri de prognostic în neoplazia tiroidiană.

Conflict de interese

Toți autorii verifică faptul că nu au acceptat nicio finanțare sau sprijin din partea unei organizații care ar putea câștiga sau pierde în vreun fel din punct de vedere financiar din rezultatele prezentului studiu. Toți autorii verifică faptul că nu au fost angajați de o organizație care ar putea în vreun fel să câștige sau să piardă financiar din rezultatele prezentului studiu. Niciunul dintre autori nu are vreun alt conflict de interese.

Contribuția autorilor

Eleftheria Lakiotaki și Constantinos Giaginis au contribuit în mod egal la studiu.

.