ChIP în afara blocului vechi: Dincolo de imunoprecipitarea cromatinei

O serie de tehnici se bazează pe o metodă clasică – imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) – pentru a evalua ce se leagă de ADN și unde. Tehnicile emergente micșorează dimensiunea probelor, interoghează complexele proteice legate de ADN sau evaluează mai îndeaproape nucleotidele implicate. Toate aceste abordări urmăresc să depășească limitările de lungă durată ale ChIP și să lărgească întrebările pe care oamenii de știință le pot pune cu privire la reglarea genelor, dezvoltare și boli.

Imunoprecipitarea cu cromatină, una dintre cele mai utilizate tehnici din biologia moleculară, a fost inventată în urmă cu peste 30 de ani – și unele lucruri despre aceasta s-au schimbat, în timp ce altele au rămas la fel.

Protocolul de bază este încă similar cu unul dezvoltat în anii 1980, implicând reticlarea proteinelor la ADN cu formaldehidă și apoi fragmentarea ADN-ului. O proteină care interacționează cu ADN-ul este imunoprecipitată cu ajutorul unui anticorp, legăturile încrucișate sunt inversate cu căldură, iar ADN-ul asociat este analizat. Ulterior, cercetătorii au legat această tehnică de secvențierea profundă, dezvoltând tehnica ChIP-seq pentru a cerceta interacțiunile proteină-ADN la scară genomică.

ChIP a fost exploatat pentru a aborda modul în care operează factorii de transcripție, modul în care histonele modulează expresia genică și alte întrebări de bază cu implicații pentru dezvoltarea biologică și boli. În septembrie, C. David Allis și Michael Grunstein au câștigat prestigiosul premiu Lasker pentru activitatea lor privind histonele – o cercetare care s-a bazat pe ChIP. Iar ChIP-seq este acum o piatră de temelie a proiectului ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements), un efort de cartografiere a regiunilor de reglementare a genomului în diferite tipuri de celule.

Biologii de cromatină dezvoltă, de asemenea, o serie de tehnologii derivate sau paralele pentru a merge dincolo de ceea ce oferă ChIP și ChIP-seq – pentru a examina complexe de proteine, pentru a evalua cu mai multă precizie nucleotidele exacte de care se leagă un factor, pentru a examina grupuri mici de celule și pentru a începe, în mod provizoriu, să evalueze interacțiunile proteină-ADN la nivelul unei singure celule.

Toate aceste tehnici urmăresc să facă lucruri pe care ChIP-seq singur nu le poate face, sau le face doar lent. Și toate au același obiectiv de bază: să afle ce molecule sunt asociate cu ADN-ul și unde.

„Nu înțelegem cu adevărat principiile fundamentale prin care secvențele funcționale de reglementare din genomul nostru determină unde și când genele se activează”, spune Bradley Bernstein, director al Programului de Epigenomică al Institutului Broad din Cambridge, Massachusetts. El adaugă că ChIP este „limitată din multe puncte de vedere. Și, prin urmare, există aceste eforturi de a încerca să inovăm noi abordări sau să adaptăm tehnologia în noi moduri.”

„Trebuie să găsim modalități precise și deterministe de evaluare directă și sistematică a interacțiunilor cu o singură moleculă în celule unice.”

Făcând-o să funcționeze

„A o numi artă întunecată este prea mult”, spune Nir Friedman, profesor de informatică și biologie la Universitatea Ebraică din Ierusalim, Israel. Dar, în ciuda faptului că este o tehnică folosită în mod obișnuit, „foarte puțini oameni sunt suficient de răbdători să își calibreze experimentele”, spune el.

Experimentele ChIP-seq generează o mulțime de zgomot, notează Friedman. Formaldehida poate încrucișa moleculele neimplicate, anticorpii pot trage în jos proteine care nu sunt vizate, iar sonicarea – cel mai comun mod de a rupe ADN-ul – tinde să rupă ADN-ul care se află într-o conformație deschisă. Spune Friedman: „Se poate întâmpla ca mai mult de jumătate din ceea ce ajungeți să secvențiați sau să analizați să fie legături nespecifice”.

ENCODE publică linii directoare pentru evaluarea calității anticorpilor și depistarea datelor nesemnificative, notează Friedman. Proiectul oferă, de asemenea, acces la instrumente computaționale recente care sunt utilizate, de exemplu, pentru a normaliza datele în raport cu controalele și pentru a identifica „vârfurile” sau regiunile de posibilă legare a ADN-ului.

Alegerea anticorpului potrivit, în special, poate fi o provocare, notează Michael-Christopher Keogh, director științific la EpiCypher, o companie de epigenomică din Research Triangle Park, Durham, Carolina de Nord. Keogh a fost implicat într-un studiu recent care a arătat că mulți anticorpi populari pentru cercetarea histonelor au performanțe slabe în ChIP, de exemplu, legându-se la epitopi care nu sunt vizați. Studiul propune, de asemenea, etape de validare dincolo de orientările ENCODE.

Câțiva cercetători ocolesc problema anticorpilor prin ingineria unei etichete epitopice pe ținta lor, ca în cazul CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq). O tehnică de lungă durată, DamID (DNA adenine methyltransferase identification), implică factori de inginerie pentru a eticheta ADN-ul vecin cu mărci moleculare.

Alți cercetători continuă să îmbunătățească tehnica ChIP de bază, cum ar fi grupul lui Alon Goren de la Departamentul de Medicină al Universității California San Diego, care a automatizat complet ChIP-seq. Goren spune că concentrația optimă de anticorpi poate varia substanțial între anticorpi și tipuri de celule și că unele etape, cum ar fi reticulația inversă, sunt inutile. Laboratorul Goren a demonstrat, de asemenea, că anticorpii monoclonali au un avantaj față de anticorpii policlonali.

Dar chiar și atunci când este complet optimizat, ChIP-seq este încă limitat în mod fundamental. De exemplu, în general, este nevoie de 100.000 sau mai multe celule pentru a evalua factorii de transcripție și de 10.000 sau mai multe pentru a evalua proteinele histonice, spune Goren. Și, în cele mai multe cazuri, metoda este orientată pentru a examina o singură proteină, câte un anticorp la un moment dat.

Dispune Goren: „Odată ce vom reuși să schimbăm viziunea de la a ne gândi la proteine la a ne gândi la complexe, vom înțelege mult mai bine cum funcționează biologia și ce se întâmplă în cazul bolilor.”

Câștigând controlul asupra complexelor proteice

O abordare pentru examinarea complexelor este combinarea ChIP-seq cu spectrometria de masă (MS), folosind metode precum RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) și ChIP-MS.

Un dezavantaj al acestor metode, totuși, este că proteinele care nu sunt asociate cu ADN-ul pot fi, de asemenea, trase în jos prin imunoprecipitare, spune David Steger, un biolog molecular de la Universitatea din Pennsylvania, în Philadelphia. În schimb, spune Steger, „ceea ce toată lumea încearcă să dezvolte este proteomica specifică unui locus la un anumit enhancer”.

O tehnică emergentă pentru a evalua complexele legate de cromatină este ChIP-SICAP (izolarea selectivă a proteinelor asociate cu cromatina), dezvoltată de echipa lui Jeroen Krijgsveld de la Centrul German de Cercetare a Cancerului din Heidelberg, Germania, și de colegii săi. Tehnica presupune marcarea cu biotină a ADN-ului legat de anticorpi, care este apoi tras în jos cu bile de streptavidină care se leagă de biotină înainte de spectrometria de masă.

Steger aplică ChIP-SICAP pentru a examina proteinele legate de potențiatori care conduc tranziția celulelor stem mezenchimale la adipocite. Spune Steger: „Ceea ce încercăm să facem este să identificăm un proteom enhancer”.

Alte abordări exploatează sistemul de editare a genelor care implică Cas9, care recunoaște ARN-uri ghid care vizează secvențe specifice de ADN. Cercetătorii au marcat Cas9 cu biotină sau cu o enzimă care promovează marcarea cu biotină a proteinelor din apropiere, care sunt analizate prin SM. Această abordare a fost, de asemenea, implementată pentru a dezvălui interacțiunile dintre elemente genomice îndepărtate. Astfel de metode ar putea extinde repertoriul metodelor legate de ChIP-seq care pot evalua arhitectura 3D a genomului, cum ar fi Hi-C, ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing) și HiChIP, precum și metode mai recente, cum ar fi SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Aceste metode emergente de evaluare a complexelor legate de ADN promit să ascută viziunea biologilor asupra reglării genelor. Dar, atunci când sunt valorificate pentru SM, ele se confruntă cu limitarea că SM nu detectează cu ușurință proteinele cu abundență scăzută, notează Steger. În plus, nu toate tehnicile noi sunt accesibile celor care nu sunt experți.

Câteva companii oferă servicii de externalizare a unor tehnici mai consacrate, cum ar fi RIME sau ChIP-seq. Printre companiile care oferă ChiP-seq și servicii conexe se numără Active Motif, din Carlsbad, California; Diagenode din Liege, Belgia și Denville, New Jersey; și Novogene, cu sediul la Beijing. Aceste și alte companii oferă, de asemenea, kituri și componente ChIP-seq, deși multe laboratoare își generează proprii reactivi. Keogh observă, de asemenea, că cercetarea internă poate însemna un control mai mare al etapelor de optimizare.

Cuviința cu parametrii experimentali în timpul experimentelor ChIP poate stimula ea însăși calitatea datelor, spune Cigall Kadoch, al cărui grup studiază mai multe complexe proteice macromoleculare mari la Dana-Farber Cancer Institute și Harvard Medical School din Boston, Massachusetts.

Kadoch are grijă să optimizeze concentrația de formaldehidă folosită pentru a reticula proteinele între ele și cu ADN-ul, pentru fiecare anticorp și tip de celulă. Atunci când alege anticorpii, ea observă dacă se preconizează că epitopul este accesibil la suprafață și, prin urmare, se pretează la imunoprecipitare. Iar pentru a vedea amprenta ADN a unui complex complet asamblat, ea sfătuiește să aleagă un anticorp împotriva unei proteine care este adăugată târziu în procesul de asamblare. „Acestea sunt lucrurile care fac sau desfac un proiect”, spune Kadoch.

Zeroing in on factor binding

O altă tehnică pe care Steger o folosește este ChIP-exo (ChIP exonuclease). El o implementează pentru a identifica – la o rezoluție de pereche de baze – unde se leagă diverși factori de genom.

Această tehnică începe cu fragmentarea ADN-ului prin sonicare. O exonuclează mestecă ADN-ul (în direcția 5′-3′) până la marginea unde ADN-ul este legat prin formaldehidă de proteina sa legată. Această abordare are ca rezultat o „amprentă” clară a ADN-ului pentru factorii legați, care poate fi mai exactă decât motivele deduse generate prin calcul cu ajutorul ChIP-seq.

„Întotdeauna începem cu ChIP-seq și, pe măsură ce întrebările noastre evoluează, trecem la ChIP-exo”, spune Steger, care a folosit tehnica pentru a evalua legarea receptorului glucocorticoid la ADN. Receptorul se leagă ca un dimer la două secvențe scurte de ADN alăturate. Steger a reușit să rezolve legarea unui singur monomer, ceea ce nu a putut face cu ChIP-seq.

Echipa lui Frank Pugh, profesor de biochimie și biologie moleculară la Penn State University din University Park, Pennsylvania, și-a simplificat recent metoda ChIP-exo și a adaptat-o la platforma de secvențiere Illumina, folosită în mod obișnuit. În mod similar, Julia Zeitlinger, cercetător asociat la Stowers Institute for Medical Research din Kansas City, Missouri, și colegii săi, au publicat o tehnică conexă, ChIP-nexus. Ambele dezvoltări sunt „promițătoare”, spune Michael Snyder, președinte al catedrei de genetică și director al Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine de la Universitatea Stanford, din California.

Mai mici și mai profunde

Cercetătorii au reușit să reducă numărul de celule necesare pentru ChIP-seq prin ajustarea parametrilor experimentali, cum ar fi utilizarea unui anticorp de înaltă calitate, spune Friedman.

Câteva tehnici, inclusiv una dezvoltată de Friedman, utilizează adaptoare de secvențiere cu coduri de bare, permițând reducerea dimensiunii eșantionului. Iar o nouă tehnică numită „ChIPmentation” reduce etapele implicate în realizarea bibliotecilor de secvențiere.

O metodă care își croiește drum spre noi laboratoare este CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), dezvoltată de Steve Henikoff și colegii săi de la Fred Hutchinson Cancer Research Center din Seattle, Washington. Această metodă renunță la reticulația prin formaldehidă, precum și la forfecarea ADN-ului prin sonicare. În schimb, un anticorp împotriva țintei este legat de nucleaza micrococală (MNase), care este activată de calciu pentru a scinda ADN-ul de o parte și de alta a țintei. Fragmentele de ADN rezultate sunt secvențiate.

„Se obține o reducere mare a raportului semnal-zgomot” în comparație cu ChIP-seq, spune John Stamatoyannopoulos, director al Altius Institute for Biomedical Sciences din Seattle. Acest lucru se datorează în parte tăierii curate a ADN-ului de către nuclează, cu niveluri scăzute de tăiere în afara locului. Ca urmare, CUT&RUN necesită de obicei mai puține lecturi de secvențiere a ADN-ului decât ChIPseq – reducând costurile – și poate fi aplicat la un număr mult mai mic de celule. Echipa lui Henikoff a aplicat recent tehnica la 1.000 de celule pentru un factor de transcripție și la 100 de celule pentru o modificare histonică. Stamatoyannopoulos spune că metoda a suplinit în mare măsură ChIP-seq în laboratoarele sale.

CUT&RUN are, de asemenea, avantaje dincolo de numărul redus de celule. Stuart Orkin, un biolog molecular și profesor la Universitatea Harvard, prezintă tehnica pentru rezoluția sa „în esență la nivel de nucleotide”. Cu mici ajustări ale instrumentelor de calcul, grupul său a reușit să diferențieze situsurile de legare foarte apropiate ale unui factor de transcripție implicat în controlul expresiei hemoglobinei fetale. Înainte de a obține acest rezultat, el nu a reușit să imunoprecipiteze factorul de transcripție cu ChIP convențional, posibil din cauza reticulației cu formaldehidă care a ascuns epitopii. CUT&RUN „a funcționat de la bun început”, spune el.

Laboratorul lui Henikoff a adaptat tehnica pentru a evalua interacțiunile ADN cu rază lungă de acțiune, 3D, și pentru a realiza imunoprecipitarea fragmentelor scindate folosind un al doilea anticorp. Grupul a interogat două caracteristici moleculare ale aceluiași complex proteic – o abordare care ar putea ajuta la rezolvarea unor întrebări cum ar fi ce combinații de mărci histonice sunt asociate cu diferite stări ale genelor.

Lucrând la nivelul unei singure celule

Pentru mulți biologi moleculari, inclusiv pentru cercetătorii de cromatină, celula unică este ultima frontieră.

„Trebuie să găsim modalități precise și deterministe de a evalua în mod direct și sistematic interacțiunile cu o singură moleculă în celule unice”, spune Bernstein. „Este un obiectiv pe termen lung”. Datele monocelulare ar putea urmări potențial factorii de legare a ADN-ului pe măsură ce celulele ies din starea de celule stem în timpul dezvoltării, sau în tumorile cu niveluri ridicate de eterogenitate celulară.

Câteva abordări se apropie din ce în ce mai mult de acest obiectiv. Cu toate acestea, „multe dintre metodele cu o singură celulă au o sensibilitate limitată”, spune Christopher Benner, un biolog de genom de la Universitatea din California, San Diego. Bernstein și colegii săi, de exemplu, au generat date ChIPseq cu o singură celulă folosind un sistem microfluidic și coduri de bare. Din fiecare celulă, tehnica a capturat între 500-10.000 de „lecturi” unice, reprezentând un eveniment de legare a ADN-ului, spre deosebire de milioanele de lecturi capturate cu populații de celule.

Diverse metode pot produce, de asemenea, date privind regiunile active ale genomului. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) implementează o transpază hiperactivă care se integrează în genom în regiunile deschise de cromatină și introduce adaptoare de secvențiere. ATAC-seq poate fi adaptată la celule unice, iar datele de secvență rezultate pot fi interogate cu o varietate de abordări computaționale. Aceste abordări pot, de exemplu, să identifice secvențe de promotori – sau să identifice modele în experimentele care elimină simultan elementele de control ale ADN-ului sau evaluează expresia ARN-ului.

ATAC-seq suferă de dezavantaje, cum ar fi integrarea incompletă în regiunile accesibile, notează Snyder. Dar tehnica poate fi puternică: ea poate fi implementată pentru a insera și a obține imagini cu fluorofori, rezultând date imagistice privind organizarea genomică 3D înainte de secvențiere, notează Snyder.

Snyder face referire la lucrările de imagistică din laboratoare precum cel al lui Alistair Boettiger de la Stanford, care dezvoltă modalități de imagistică simultană a elementelor genetice și a transcriptelor de ARN nou apărute cu ajutorul imagisticii de superrezoluție, pentru a evalua ce elemente promovează sau reprimă expresia genelor. „Imagistica este viitorul”, adaugă Stamatoyannopoulos. Alți cercetători remarcă faptul că, pe măsură ce se îmbunătățește secvențierea cu nanopori de „a treia generație”, vor fi dezvoltate metode de tip ChIP care să se conecteze la aceasta.

„S-ar putea să avem nevoie de modalități complet ortogonale de a face acest lucru”, spune Bern-stein despre analiza cromatinei monocelulare. Acest obiectiv va fi probabil va fi realizat cu succes în cele din urmă, spune el, cu „tehnologii care sunt o abatere radicală de la ceea ce folosim acum”.

Subscrieți comunicatul de presă/descrierea noului dumneavoastră produs sau informații despre literatura de specialitate a produsului la [email protected]. Vizitați Science New Products pentru mai multe informații.

În acest spațiu sunt prezentate instrumente, aparate și materiale de laborator nou oferite, de interes pentru cercetătorii din toate disciplinele din organizații academice, industriale și guvernamentale. Accentul este pus pe scopul, caracteristicile principale și disponibilitatea produselor și materialelor. Aprobarea de către Science sau AAAS a oricăror produse sau materiale menționate nu este implicită. Informații suplimentare pot fi obținute de la producător sau furnizor.

.