Analiza evolutivă a genei gyrA de la tulpini bacteriene Neisseria meningitidis din complexul clonal 4821 colectate în China între 1978 și 2016

Analiza evolutivă a 77 de secvențe nucleotidice gyrA din CC4821 N.meningitidis tulpini

Saptezeci și șapte de secvențe gyrA de novo din CC4821 N.meningitidis au fost analizate în contextul a 149 de secvențe gyrA disponibile public (enumerate în Tabelul suplimentar 1). A fost construit un arbore filogenetic de alăturare a vecinilor cu setul de date rezultat de 226 de secvențe de nucleotide gyrA (Fig. 1). Un arbore similar a fost obținut utilizând metoda de maximă verosimilitate (ML) (Figura suplimentară 1). Secvențele de nucleotide au fost semnificativ divergente, cu o p-distanță globală de 0,045 (tabelul 1). O imagine de ansamblu a arborelui a arătat că secvențele din tulpinile CC4821 N.meningitidis (în roșu în Fig. 1) s-au regăsit în tot arborele, demonstrând că gena gyrA a fost relativ divergentă în cadrul acestor tulpini.

Arbore filogenetic de îmbinare a vecinilor a 226 de secvențe ale genei gyrA din tulpini de Neisseria. Denumirea tulpinii este indicată după cum urmează: denumirea speciei-GB ID-strain ID-ST-CC-Serogrup-țară de colectare-an de colectare-fenotip de rezistențăCIP. Informațiile care lipsesc sunt indicate printr-un spațiu gol. De exemplu, N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Germania-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Coreea de Sud-2017. Numele secvențelor din tulpinile de N.meningitidis CC4821 sunt indicate cu font roșu. Cele 77 de secvențe generate în acest studiu sunt subliniate. Secvențele a 9 tulpini de referință sunt indicate printr-un punct negru. Valorile Bootstrap > 70% sunt indicate. Valorile Bootstrap < 70% sunt indicate în paranteză atunci când este necesar. Cele 9 grupuri genetice identificate în acest studiu sunt indicate prin linii verticale între paranteze. Fenotipul de rezistență la CIP este indicat cu R pentru rezistență, S pentru sensibil și I pentru fenotip de rezistență intermediară

Printre cele 226 de secvențe analizate, aproape 62% dintre secvențe (140) s-au regăsit în vârful arborelui, fără o valoare bootstrap semnificativă (Fig. 1). Aceste secvențe au fost foarte omogene, cu o distanță p de 0,003 (tabelul 1). Cele 86 de secvențe rămase au fost mai divergente, cu o p-distanță de 0,066 în raport cu secvențele grupate în vârful arborelui. Majoritatea nodurilor referitoare la aceste 86 de secvențe au prezentat o valoare bootstrap > 70%. Mai mult, distanța p în cadrul acestui grup de 86 de secvențe a fost de 0,09, demonstrând că aceste secvențe erau foarte divergente între ele. Deoarece nodurile majore ale arborelui prezentau o valoare bootstrap > 80%, am decis să atribuim în mod arbitrar secvențele la 9 grupuri genetice diferite (Fig. 1; Tabelul 1). Aceste 9 grupuri s-au regăsit, de asemenea, în arborele ML (Figura suplimentară 1). Secvențele gyrA din tulpinile CC4821 au fost găsite în 6 dintre aceste grupuri genetice, și anume grupul 1, 2, 3, 5, 6 și 8.

Grupul 1 a constat din 2 secvențe, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 și N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Acest grup a fost susținut de un bootstrap de 100%, sugerând că aceste 2 secvențe erau foarte diferite de restul secvențelor. Secvențele au avut în comun 7 modificări de aminoacizi (tabelul 1, tabelul suplimentar 2). Cu toate acestea, ramura lungă corespunzătoare secvenței N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 a sugerat că această secvență a fost, de asemenea, semnificativ divergentă față de N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005, iar acest lucru a fost confirmat de o distanță p de 0,06 între aceste 2 secvențe (Tabelul 1).

Grupul 2 a fost format din 2 secvențe de la N. meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 și acest lucru a fost confirmat de o distanță p de 0,06 între aceste 2 secvențe (Tabelul 1).meningitidis colectate în provincia Gansu și Guangxi din China în 2007 și 2011, și anume N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R și N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Grupul 3 a constat dintr-o singură secvență, și anume, N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Nodul corespunzător acestei secvențe a fost susținut de o valoare bootstrap de 80 %. Mai mult, cea mai mică p-distanță pe perechi între această secvență și celelalte secvențe analizate a fost de 0,032, demonstrând că această secvență a fost semnificativ divergentă în comparație cu restul secvențelor analizate (tabelul 1).

Grupul 5 a fost format din 26 de secvențe, în principal din N.meningitidis, inclusiv 9 din CC4821. Un subgrup de 7 secvențe susținute de un bootstrap de 100% a prezentat 5 secvențe din N.lactamica. În mod interesant, N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 s-a grupat cu secvențe de N.lactamica cu un bootstrap de 100% și o ramură lungă.

Grupul 6 a constat din 27 de secvențe de N. meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009.meningitidis (8 din CC4821) și 1 secvență din N. cinerea, și anume N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, care a împărțit un nod cu N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. Cu toate acestea, secvența N.cinerea a prezentat o ramură lungă care sugerează o divergență semnificativă în comparație cu secvența N.meningitidis. Pe baza datelor disponibile, secvențele din grupul 6 păreau să provină din tulpini care erau rezistente la CIP. Cu toate acestea, nici o substituție unică de aminoacizi nu a fost împărtășită de aceste tulpini, sugerând că nu a existat un marker comun pentru fenotipul de rezistență al acestor tulpini (Tabelul suplimentar 2).

Grupa 8 conținea majoritatea secvențelor N.meningitidis (64%) analizate în acest raport. Tulpinile au fost colectate în ultimii 88 de ani în 13 țări diferite de pe 4 continente. În ciuda intervalului de timp semnificativ și a răspândirii geografice, aceste secvențe au fost foarte conservate, cu o distanță p de 0,003. În plus, aceste secvențe proveneau de la tulpini din 68 ST, 24 CC, 9 serogrupuri, inclusiv tulpina de referință 053442. În general, aceste observații au arătat că gena gyrA a fost foarte conservată în rândul majorității tulpinilor de N.meningitidis, în ciuda caracteristicilor genetice diferite, a locațiilor geografice sau a timpului de colectare.

Analiza divergenței în cadrul proteinei GyrA

Divergența aminoacizilor în cadrul proteinei GyrA a fost analizată în rândul a 129 de secvențe unice (Tabelul suplimentar 2). Două sute cincizeci și șapte de poziții divergente au fost identificate printre cei 931 de aminoacizi prezentați în aliniere (Fig. 2). Chiar dacă aceste poziții au fost găsite în întreaga proteină, distribuția divergenței nu a părut a fi aleatorie. Într-adevăr, două regiuni au fost foarte bine conservate, de la pozițiile 530 la 620 și o regiune mai mică între 300 și 330. Conform proteinei din E.coli, prima regiune corespunde sfârșitului domeniului amino terminal și începutului domeniului carboxi terminal. A doua regiune corespunde domeniului turn al proteinei pe baza structurii modelului 3D (Fig. 2).

Diferența de aminoacizi între proteinele GyrA pe baza a 129 de secvențe unice. Pozițiile din cadrul alinierii lungi de 932 de aminoacizi sunt indicate pe axa X. Procentul de secvențe care prezintă o anumită poziție divergentă este indicat pe axa Y (partea stângă). De exemplu, 58% dintre secvențe prezintă o mutație la poziția 91. Graficul de divergență a fost generat din tabelul de diferențe de aminoacizi prezentat în tabelul suplimentar 2. Alinierea prezintă 10 lacune, iar numărul de secvențe care prezintă lacune este indicat pe axa din dreapta și prezentat sub forma unui pătrat negru. O hartă a proteinei GyrA din E.coli care prezintă domeniile structurale și funcționale este prezentată în partea de jos pentru comparație. Harta a fost generată pe baza următoarelor referințe . Secvența proteinei GyrA din E.coli și tulpina de referință N.meningitidis 053442 (GB-ID CP000381) a fost comparată (tabelul suplimentar 4). Situl cunoscut rezistent la CIP din E.coli este indicat, iar pozițiile corespunzătoare din N.meningitidis sunt indicate cu o linie albastră. Este demn de remarcat faptul că, dintre cele 8 situsuri rezistente raportate în E.coli, doar pozițiile 83 și 87 sunt divergente în N.meningitidis (situsurile 91 și 95)

Printre cele 257 de poziții divergente, niciuna nu a fost împărtășită de toate secvențele gyrA analizate ale tulpinilor CC4821. Cinci poziții (91, 417, 665, 210 și 288) au fost foarte divergente, 40% sau mai mult din cele 129 de secvențe au fost mutate în aceste poziții. De exemplu, 48% din cele 129 de secvențe prezentau un reziduu mutat la poziția 417 (Fig. 2). O poziție (91) a părut să fie legată de rezistența la CIP, toate tulpinile care nu au fost sensibile la CIP au fost mutate în această poziție, prezentând fie un I, fie un F sau un V (Tabelul suplimentar 2).

Identificarea markerilor potențiali de rezistență la CIP

Printre cele 226 de secvențe analizate, 174 proveneau din tulpini testate pentru rezistența la CIP (Tabelul suplimentar 1). Șaizeci și șapte de tulpini au fost testate pentru acest studiu. După cum s-a menționat mai sus, toate tulpinile care nu au fost sensibile la CIP (fie cu un fenotip rezistent (R în arbore), fie cu un fenotip intermediar (I în arbore)) au suferit mutații la poziția 91. Acest lucru a arătat că o mutație la poziția 91 era legată de mecanismul de rezistență. Dintre cele 67 de tulpini testate în acest studiu, 49 au suferit mutații la poziția 91, dar 23 dintre aceste tulpini au avut un fenotip de rezistență intermediară. Acest lucru a sugerat că alte poziții ar putea fi implicate în mecanismul de rezistență. Pentru a identifica markerii potențiali suplimentari pentru rezistență, cele 226 de tulpini au fost analizate în continuare la fiecare poziție mutantă. O modificare care ar fi fost găsită în tulpinile rezistente (inclusiv fenotipul de rezistență intermediară), dar care nu ar fi fost găsită în nicio tulpină sensibilă, ar fi calificată. Cu toate acestea, pentru a crește rigurozitatea analizei, o mutație găsită într-o singură tulpină nu ar fi luată în considerare. În total, au fost identificate 33 de situri (tabelul suplimentar 3; partea stângă a tabelului suplimentar 4). De exemplu, H8N a fost găsit în 18 tulpini rezistente (inclusiv 2 cu fenotip intermediar), dar nu a apărut în nicio tulpină sensibilă. Toate cele 226 de tulpini au fost analizate pentru aceste 33 de poziții. Încă o dată, pentru a crește rigurozitatea analizei, o mutație găsită în cel puțin o tulpină sensibilă ar fi fost eliminată. Astfel, mutația D95N găsită în tulpinile rezistente și sensibile nu a fost luată în considerare în continuare. În total, au fost analizate 39 de mutații (unele la aceeași poziție, cum ar fi poziția 91) (în verde în partea stângă a tabelului suplimentar 4). A fost construit un profil de mutații pentru cele 128 de tulpini care prezentau cel puțin o mutație de interes (Tabelul suplimentar 3). Au fost identificate 46 de profiluri diferite, ceea ce înseamnă că au existat 46 de combinații ale acestor 39 de mutații printre toate tulpinile analizate (partea dreaptă a Tabelului suplimentar 4). Șaisprezece dintre cele 46 de profiluri de mutații au vizat tulpinile CC4821 (numere în roșu în Tabelul suplimentar 4). Douăzeci și șase de profiluri se refereau la tulpini despre care se știa că sunt rezistente la CIP (nume de tulpini cu caractere albastre în tabelul suplimentar 4). Dintre cei 39 de potențiali markeri de rezistență, mutațiile N103D și T91I au fost cele mai împărtășite în profiluri, cu 29 și, respectiv, 27 de apariții. Cu toate acestea, este demn de remarcat faptul că și alte mutații au fost bine reprezentate, cum ar fi H8N, I111V, E793Q și A679S, cu 23, 21, 18 și, respectiv, 17 apariții. De asemenea, este demn de remarcat faptul că 45 % dintre tulpinile rezistente (58 din 128) prezentau doar mutația T91I. Deoarece markerii de rezistență au fost descriși inițial în E.coli, a fost necesară o comparație între secvențele gyrA din E.coli și tulpina de referință N.meningitidis 53,442 pentru a verifica poziția acestor markeri în secvența E.coli (Tabelul suplimentar 5).

Recombinație în cadrul genei gyrA între N. spp.

Analiza filogenetică a identificat potențiali recombinanți. De exemplu, grupul 1 a prezentat un interes deosebit, privind N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 și N.subflava-CP031251.1-M18660. Aceste 2 secvențe au avut în comun 7 modificări de reziduuri, care nu au fost observate în alte tulpini. În plus, 5 dintre aceste modificări au fost observate în cadrul a 30 de aminoacizi (tabelul 1). În cele din urmă, modificările de aminoacizi observate într-o tulpină nu au fost observate în cealaltă tulpină, cum ar fi poziția 740 și 750. Toate aceste observații au sugerat o recombinare între aceste 2 tulpini, care a fost confirmată de o analiză BootScan (Fig. 3a). Alte trei recombinări potențiale au fost confirmate prin BootScan. Fig. 3b descrie o recombinare între o tulpină CC4821 (probabil fie N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016, fie N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) și N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Fig. 3c prezintă multiple evenimente de recombinare între N.lactamica-CP031253.1-M17106—– și două tulpini N.meningitidis, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– și N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. În cele din urmă, o recombinare între tulpinile N.meningitidis a fost prezentată în Fig. 3d. În ansamblu, analiza de recombinare a arătat că gena gyrA a tulpinilor de Neisseria este foarte predispusă la recombinare.

Evenimente potențiale de recombinare inter- și intra-specie între tulpinile de Neisseria. a. Recombinare între N.subflava și N.meningitidis. Un grafic BootScan a fost generat în SimPlot cu N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 ca interogare. b. Recombinare între N.cinerea și N.meningitidis. Un grafic BootScan a fost generat în SimPlot cu N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R ca interogare. c. Recombinare între N.lactamica și N.meningitidis. Un grafic BootScan a fost generat în SimPlot cu N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 ca interogare. d. Recombinarea între tulpinile N.meningitidis. Un grafic BootScan a fost generat în SimPlot cu N.meningitidis-MK93030446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 ca interogare. Tulpina care se preconizează că va contribui cel mai mult la procesul de recombinare (coloana vertebrală) este reprezentată printr-o linie roșie. Tulpina de referință N.meningitidis 053442 (GB ID CP000381) este reprezentată printr-o linie neagră. O hartă funcțională pentru tulpina de referință 053442 este prezentată mai sus pe baza hărții funcționale a E.coli prezentate în Fig. 2

.