A Universal Heparin Antidote with Negligible Effect on Fibrin(ogen) and Plasma Coagulation

Background and Objective

Anticoagulantele joacă un rol esențial în tratamentul tulburărilor tromboembolice. Hemoragia la pacienții chirurgicali care primesc anticoagulante reprezintă o preocupare majoră. Se administrează antidoturi pentru a contracara anticoagularea și pentru a restabili hemostazia normală. Până în prezent, sulfatul de protamină (PS), o polipeptidă cationică, este singurul antidot aprobat clinic pentru heparina nefracționată. PS are efecte secundare toxice și limitări. Incapacitatea PS de a inversa complet heparinele cu greutate moleculară mică și fondaparinux se datorează afinității sale scăzute de legare la aceste medicamente. Cu toate acestea, PS interacționează cu proteinele de coagulare, cum ar fi fibrinogenul, pentru a forma agregate, ceea ce duce la efecte adverse cardiovasculare. Recent, am dezvoltat un agent sintetic universal de reversie a heparinei (UHRA) cu afinitate de legare ridicată pentru heparine. Studiile in vivo au arătat că UHRA inversează complet activitatea tuturor anticoagulantelor parenterale disponibile clinic și nu este toxic. Acest studiu își propune să demonstreze natura non-toxică a UHRA prin evaluarea influenței sale asupra fibrinogenului, a arhitecturii cheagului de fibrină, a coagulării plasmei și a lizei cheagului.

Metode

UHRA a fost dezvoltat prin încorporarea grupărilor de legare a heparinei pe bază de amine terțiare pe o schemă de poliglicerol hiperbranșat dendritic și prin acoperirea acesteia cu lanțuri de metoxi-poli-etilenglicol. Pentru a înțelege impactul UHRA asupra sistemului de coagulare, s-au efectuat teste de recalcifiere și teste de coagulare a plasmei turbidimetrice inițiate de factorul tisular (TF). Interacțiunea UHRA cu fibrinogenul a fost investigată prin testul de agregare a fibrinogenului, testul de polimerizare a fibrinei și prin analiză spectroscopică (fluorescență și dicroism circular (CD)). Influența UHRA asupra arhitecturii cheagului de fibrină a fost evaluată prin microscopie electronică de baleiaj (SEM).Neutralizarea anticoagulantului (heparine) de către UHRA a fost studiată prin testul fluorogenic de generare a trombinei (TGA) în plasma umană bogată în trombocite (PRP). Liza cheagului de plasmă indusă de TF care conține UHRA sau PS expus la activator tisular de plasminogen exogen (t-PA) a fost studiată prin testul turbidimetric.

Rezultate și discuții

Rezultatele din testele de coagulare a plasmei au arătat că UHRA nu a modificat parametrii de coagulare în comparație cu PS (timpul de întârziere inițiat de TF și absorbția maximă, control vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 și, respectiv, 0,16; timpul de întârziere și absorbanța maximă în recalcificare, control vs UHRA 200mcg/mL, p=0,08 și, respectiv, 0,13), sugerând că UHRA nu are niciun efect asupra sistemului de coagulare la concentrația studiată (figura 1). Spre deosebire de protamină, testul de agregare a fibrinogenului și de polimerizare a fibrinei nu a fost influențat de UHRA pe o gamă largă de concentrații, de la 0,05mg/mL la 1mg/mL. Împreună cu măsurătorile de stingere a fluorescenței triptofanului (figura 2) și măsurătorile structurii secundare a fibrinogenului coroborează faptul că UHRA nu interacționează cu fibrinogenul. Rezultatele sunt destul de diferite de cele ale PS și ale altor polimeri cationici sintetici care interacționează cu fibrinogenul provocând agregare și modificări conformaționale. Cheagurile de fibrină generate în prezența UHRA (chiar și la 0,5 mg/mL) au prezentat o structură similară, iar dimensiunea fibrelor rămâne aceeași cu cea a cheagului de fibrină normal (cheagul de control vs. cheagul UHRA 0,5 mg/mL, p= 0,12) (figura 3) (figura 3). Pe de altă parte, cheagurile de fibrină formate în prezența a 0,05mg/mL PS (doza clinică) au crescut dimensiunea fibrelor și au schimbat dramatic structura cheagului (control vs cheag PS 0,05mg/mL, p< 0,0001). Studiile noastre de liză a cheagului de plasmă în prezența t-PA exogen demonstrează că UHRA nu a îmbunătățit degradarea cheagului, spre deosebire de protamină. UHRA a restabilit nivelurile de trombină în PRP anticoagulat (heparinizat), demonstrând eficacitatea.

Concluzie și semnificație

Studiile noastre demonstrează că antidotul universal de heparină, UHRA, are un impact neglijabil asupra fibrinogenului, polimerizării fibrinei, structurii cheagului, degradării cheagului și sistemului de coagulare, dezvăluind hemocompatibilitatea lor excelentă în comparație cu protamina. Rezultatele noastre susțin faptul că UHRA ar putea fi un antidot ideal pentru a restabili hemostaza în urma procedurilor chirurgicale invazive și pentru a aborda complicațiile hemoragice cauzate de anticoagulantele pe bază de heparină.

Nu există conflicte de interese relevante de declarat.