Visão geral das Enzimas de Deacetylase Histórica e Inibidores de Deacetylase Histórica
Abstract
O importante papel das enzimas deacetylase histônica na regulação da expressão gênica, proliferação celular e sobrevivência tornou-as alvos atrativos para o desenvolvimento de inibidores de deacetylase histônica como drogas anticancerígenas. O ácido hidroxâmico suberoililida (Vorinostat, Zolinza), um análogo estrutural da Trichostatina A prototípica, foi aprovado pela US Food and Drug Administration para o tratamento do linfoma cutâneo avançado de células T em 2006. Seguiu-se a aprovação do peptídeo cíclico, depsipeptídeo (Romidepsin, Istodax) para a mesma doença em 2009. Atualmente, numerosos inibidores da deacetilase histônica estão sendo submetidos a ensaios pré-clínicos e clínicos para o tratamento de neoplasias hematológicas e malignas sólidas. A maioria destes estudos está focada em combinações de inibidores da deacetilase histônica com outras modalidades terapêuticas, particularmente a quimioterapia e a radioterapia convencionais. O objetivo deste trabalho é fornecer uma visão geral das enzimas clássicas da deacetilase histonal e dos inibidores da deacetilase histonal com ênfase em potenciais terapias de combinação.
1. Introdução
Cromatina é uma estrutura dinâmica que, através de numerosos mecanismos incluindo a metilação do DNA e modificações da história pós-tradicional, sofre remodelação para facilitar os processos metabólicos, incluindo transcrição, replicação e reparação . Uma das modificações pós-tradução bem investigadas da história é a acetilação, que foi definida pela primeira vez nos anos 60. A acetilação de histona é controlada pelas ações opostas de dois grupos de enzimas, a saber, as acetiltransferases de histona (HATs) e as deacetylases de histona (HDACs). Os HATs catalisam a transferência da fracção acetil do substrato acetil-coA para o grupo ε-amino de resíduos de lisina nas histonas. Isto neutraliza a carga positiva das histonas, enfraquecendo sua interação com o DNA carregado negativamente. Isto resulta em uma conformação cromatina mais relaxada, transcritivamente permissiva. As enzimas HDAC removem grupos acetil das histonas, resultando em um estado de cromatina mais condensado e transcritivamente repressivo .
As 18 enzimas HDAC de mamíferos identificadas até o momento são categorizadas em dois grupos distintos. As enzimas HDAC classe III que incluem as sirtuínas 1-7 requerem nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) para desacetilar resíduos de lisina. Estes têm sido implicados com numerosas doenças e no processo de envelhecimento . As 11 enzimas restantes são tipicamente conhecidas como as enzimas clássicas HDAC e serão o foco das restantes deste trabalho . Um intenso interesse na função e manipulação farmacológica destas enzimas rapidamente se seguiu à clonagem e caracterização inicial dos primeiros HDACs humanos nos anos 90 . As diferentes isoformas das enzimas do HDAC clássico foram submetidas a uma extensa análise filogenética e estão agrupadas em três classes diferentes (Figura 1) . As enzimas da classe 1, que consistem em HDAC1, 2, 3 e 8, que compartilham similaridade com o regulador transcripcional de levedura RDP3, estão localizadas principalmente no núcleo. Elas são expressas de forma omnipresente e têm importantes papéis funcionais na regulação da proliferação celular e sobrevivência . Em contraste, as enzimas HDAC classe II, que compartilham a homologia com a levedura Hda1, são transportadas entre o citoplasma e o núcleo, e têm padrões de expressão mais restritos e funções reguladoras específicas dos tecidos. As enzimas classe II são ainda subdivididas em classe IIa (HDAC4, 5, 7 e 9; vaivém entre o núcleo e o citoplasma) e classe IIb (HDAC6 e 10; principalmente citoplasmática) . As funções das diferentes isoformas das enzimas HDAC têm sido revistas recentemente . De particular interesse é a HDAC6, uma grande deacetilase citoplasmática que tem sido relativamente bem caracterizada, pelo menos em parte, devido ao trabalho com tubacina, um inibidor específico. Numerosos alvos de proteínas não-histônicas para HDAC6 foram identificados, incluindo α-tubulina, cortactina, outras acompanhantes, e peroxiredoxinas . Um papel importante na proliferação e sobrevivência celular tornou o HDAC6 um alvo importante para a terapia do câncer. Descobertas recentes indicaram os efeitos citotóxicos e apoptóxicos combinados da tubacina inibidora específica do HDAC6 com agentes quimioterápicos convencionais em células cancerosas, mas não em células normais . Além disso, foi demonstrado que o HDAC6 é um alvo importante para a protecção e regeneração após uma lesão do sistema nervoso central. O HDAC11 é o único membro da classe IV que compartilha similaridade com enzimas de classe I e classe II . Evidências recentes indicam que o HDAC11 tem papéis imunomoduladores .
2. Histone Deacetylase Inhibitors
Several different structural groups of compounds are known to possess HDAC inhibition activity. O inibidor da HDAC mais investigado é o ácido hidroxâmico prototípico, Trichostatina A . A Trichostatina A é um potente antibiótico antifúngico que foi isolado de um metabolito de Streptomyces hygroscopicus . É um potente inibidor HDAC de amplo espectro com ensaios sem células, indicando uma afinidade relativamente alta para todas as enzimas das classes I, II e IV. Outro exemplo de uma hidroxâmica é o ácido hidroxâmico suberoililida clinicamente disponível (SAHA, Vorinostat, Zolinza) . Tal como a Trichostatina A, o SAHA é um potente inibidor de HDAC de amplo espectro. Devido aos seus potentes efeitos anticancerígenos e janela terapêutica favorável, o SAHA foi aprovado pela US Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento do linfoma cutâneo avançado de células T (CTCL) em 2006 . Outros ácidos hidroxâmicos actualmente em ensaios clínicos incluem o belinostato (PXD101), o panobinostato (LBH589) e o givinostato (ITF-2357). Esta classe de compostos possui atividade de inibição do HDAC na faixa de nanomolares a baixos micromolares .
Os peptídeos cíclicos que incluem trapoxina e depsipeptídeo também são potentes inibidores do HDAC. O depsipeptídeo (Romidepsina, Istodax) também foi aprovado pela FDA para o tratamento do CTCL em 2009 . Da mesma forma, as benzamidas que incluem entinostato (MS-275, SNDX 275) e MGCD0103 são potentes inibidores do HDAC com atividade na faixa de micromolares baixos . A classe menos potente de inibidores HDAC são os ácidos alifáticos que possuem atividade na faixa milimolar . Este grupo inclui o ácido valpróico, um composto que tem sido usado extensivamente na clínica como um medicamento antiepiléptico . Utilizamos outro exemplo de ácido alifático, butirato de sódio, para destacar os efeitos anticancerígenos dos inibidores da deacetilase histônica (Figura 2).
Visão geral dos efeitos biológicos dos inibidores da deacetilase histonal (HDAC) em células malignas e transformadas, usando butirato de sódio (NaB) como exemplo. (a) Representação esquemática simplificada das vias moleculares responsáveis pelo potencial clínico dos inibidores de HDAC na terapia do câncer. O estado de acetilação das histonas é regulado pelas ações opostas das histonas acetiltransferases (HATs) e HDACs. Os inibidores da HDAC medeiam os efeitos anticancerígenos através de alterações mediadas pela histone-hiperactilação (Δ) na expressão de certos genes e pela interação direta com numerosas proteínas-chave intracelulares não-histônicas, incluindo α-tubulina, proteína 90 do choque térmico e Ku70. Os inibidores HDAC resultam na ativação transcripcional e repressão de 2-20% dos genes; alguns dos quais estão associados com diferenciação, parada do ciclo celular, apoptose, inibição do crescimento e morte celular, bem como inibição da migração, invasão e angiogênese das células cancerígenas. (b) Efeitos biológicos do butirato de sódio (NaB) nas células cancerígenas e normais. (i) O butirato de sódio causa hiper-acetilação das histonas nos miócitos cardíacos H9c2. As células foram diferenciadas com 10 nM de ácido all-trans-retinóico por 7 dias em meio sérico baixo, antes da incubação de 24 horas com butirato de sódio 2 e 5 mM. Os lisados celulares totais foram immunoblotted para a história acetilada H3, e a história não modificada H3 foi usada como controle de carga. (ii) O butirato de sódio causa redução da viabilidade celular nas células eritroleucêmicas humanas K562 e nos miócitos cardíacos H9c2. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de butirato de sódio durante 24 horas, e a viabilidade celular relativa foi medida usando o kit de ensaio Cell Titer blue (Promega). (iii) O butirato de sódio induz apoptose em células K562. As células foram tratadas com butirato de sódio 10 mM por 24 horas, e a atividade caspase 3/7 foi medida usando o kit de ensaio Apo-ONE Homogeneous (Promega). (iv) O butirato de sódio causa a parada de células K562 na fase G1 do ciclo celular. Células não tratadas (topo) e células tratadas com butirato de sódio 5 mM (fundo) durante 24 horas foram coradas com iodeto de propidium, e a distribuição do ciclo celular foi examinada por citometria de fluxo.
Briefly, os inibidores HDAC resultam no acúmulo de histórias hiper-acetiladas e demonstraram alterar a expressão de aproximadamente 2-20% dos genes em linhas celulares malignas . Em geral, os inibidores HDAC mostraram diminuir a proliferação celular, induzir a morte celular, apoptose e diferenciação, causar parada do ciclo celular (G1 em concentrações mais baixas e G1 e G2/M em concentrações relativamente altas) e diminuir a migração, invasão e angiogênese em linhas celulares malignas e transformadas . Os efeitos dos inibidores da HDAC são muito menos pronunciados, pelo menos por um factor 10, nas células normais, fornecendo a base da sua utilidade clínica no cancro . Para potencialmente melhorar o índice terapêutico dos inibidores do HDAC na terapia do câncer, foram sugeridos compostos seletivos de classe ou isoforma específica. Neste contexto, a tubacina específica da isoforma e o PC-34051 que inibem seletivamente o HDAC6 e o HDA8, respectivamente, são exemplos. Ambos os compostos demonstraram recentemente possuir efeitos anticancerígenos. Entretanto, a questão da seletividade permanece controversa com argumentos que sugerem que os efeitos pleiotrópicos dos inibidores de HDAC de amplo espectro, que geralmente são bem tolerados, podem ser vantajosos para a terapia do câncer, dada a heterogeneidade e adaptabilidade das células malignas. Entretanto, é geralmente aceito que compostos seletivos provavelmente serão mais benéficos para aplicações não oncológicas dos inibidores de HDAC, que potencialmente incluem tratamento de hipertrofia cardíaca, asma e vários distúrbios neurodegenerativos .
3. Terapias Combinatórias com Inibidores de Deacetylase Histone
Embora tenham efeitos anticancerígenos intrínsecos, é amplamente aceito que os inibidores de HDAC serão mais eficazes quando usados em combinação com outras modalidades de câncer. Existem numerosas combinações que estão actualmente a ser submetidas a uma avaliação pré-clínica e clínica. Estas incluem combinações com inibidores de metiltransferase como azacitidina, citotóxicos mediados por receptores como o ácido retinóico, e fototerapia. Para destacar as vantagens e potenciais complexidades, aqui vamos focar as combinações de inibidores da HDAC com a quimioterápica e radioterapia convencional antraciclínica (Figura 3).
(a)
(b)
(a)
(b)
Vias moleculares contabilizando os efeitos aditivos e/ou sinérgicos de combinações de inibidores HDAC com quimioterápicos ou radiação. (a) Representação esquemática simplificada. Efeitos citotóxicos aditivos e/ou sinérgicos com o uso de combinações de inibidores do HDAC e quimioterápicos podem ser o resultado de alterações na conformação da cromatina em si (particularmente nos casos em que são usadas combinações com DNA visando drogas como as antraciclinas, que requerem acessibilidade ao DNA). Da mesma forma, os inibidores HDAC podem aumentar os efeitos citotóxicos da radiação ionizante e ultravioleta (UV), aumentando a acessibilidade do ADN aos danos. Um mecanismo adicional envolve a regulação mediada por HDACi da transcrição de genes – em particular a diminuição da expressão de genes para Ku70, Ku86, DNA-PKcs e Rad51 que são componentes chave de vias de reparação de dupla quebra de cadeia. Paradoxalmente, os inibidores HDAC têm demonstrado proteger dos efeitos da radiação ionizante in vivo, diminuindo a expressão de citocinas inflamatórias como o fator de necrose tumoral, TNF-α, e fatores de crescimento fibrogênicos como TGF-β1 e TGF-β2. (b) A triquostatina A (TSA) aumenta os danos ao ADN induzidos pela fototerapêutica orientada pelo ADN (UVASens), radiação ionizante e agentes quimioterápicos. No exemplo mostrado, a formação de dupla quebra de DNA foi avaliada através de coloração para γH2AX foci. As células foram tratadas com 1 μM TSA durante 24 horas antes da incubação de uma hora com 0,1 μM UVASens. As células foram então irradiadas com 10 J/m2 UVA e incubadas por mais uma hora antes de serem coradas para γH2AX. Também são representados os controlos apropriados de 10 J/m2 e UVASens apenas. Em experiências separadas, as células foram tratadas com 1 μM TSA durante 24 horas antes da irradiação com 2 Gy (137Cs). As células foram coradas para γH2AX foci uma hora após a irradiação. Em outros experimentos, as células foram tratadas com 1 μM TSA durante 24 horas antes da incubação de uma hora com 1 μM doxorubicina. As células foram lavadas e incubadas por mais 24 horas antes da coloração para γH2AX.
As antraciclinas, tipificadas pela daunomicina e sua doxorubicina análoga estrutural, são agentes quimioterápicos cancerígenos de primeira linha, com uma história clínica de mais de 50 anos . São conhecidos intercaladores de DNA e inibidores da enzima topoisomerase II. Os mecanismos de ação das antraciclinas envolvem inibição da síntese de RNA, geração de espécies reativas de oxigênio e acúmulo de lesões de DNA, incluindo as quebras particularmente letais de DNA de dupla cadeia. Uma infinidade de estudos tem mostrado que os inibidores HDAC podem potencializar os efeitos citotóxicos das antraciclinas. Por exemplo, a Trichostatina A mostrou aumentar a apoptose induzida pela doxorubicina e a morte celular em células humanas eritroleucêmicas K562, carcinoma anaplásico da tireóide e células do adenocarcinoma alveolar A549 . Da mesma forma, o SAHA e o ácido valpróico demonstraram aumentar a sensibilidade das células malignas aos efeitos da doxorrubicina . Os inibidores da HDAC induzem hiperacetilação histonal, resultando em uma conformação transcriptionally mais aberta da cromatina permissiva, um fenômeno que tem sido verificado por ensaios de digestão MNase . Além disso, foi demonstrado que os inibidores de HDAC aumentam o número de sítios de ligação e também a afinidade desses sítios com as antraciclinas na cromatina acetilada . Portanto, pode-se especular que os inibidores de HDAC podem aumentar a morte celular induzida por anthraciclinas, pelo menos em parte, alterando a arquitetura da cromatina. Entretanto, o inibidor HDAC mediado por mudanças na expressão gênica e alteração da função de substratos não-histônicos também está envolvido, como destacado por estudos com inibidores isoforma-seletivos .
O efeito citotóxico aditivo e/ou sinérgico fornece a base para os ensaios clínicos usando combinações de inibidores deacetilase histônica e antraciclinas para várias neoplasias malignas . No entanto, foram identificadas potenciais complicações. Por exemplo, foi demonstrado que o depsipeptídeo upregula o gene MDR1 em células de leucemia, resultando em resistência à doxorubicina . A expressão da bomba de glicoproteína P codificada MDR1 é bem conhecida por resultar em resistência a múltiplas drogas, um grande problema clínico em oncologia, e o potencial de reversão da repressão do gene MDR1 em células malignas por uma variedade de inibidores HDAC foi indicado por outros estudos . Em contraste, outros estudos mais recentes indicaram que os inibidores do HDAC podem suprimir a expressão dos transportadores de ABC, destacando que esta questão requer maior esclarecimento .
Outra complicação potencial com o uso de inibidores do HDAC é a toxicidade cardíaca. Estudos demonstraram que inibidores de HDAC de amplo espectro podem possuir atividade cardiotóxica per se . Outros estudos mostraram que o pré-tratamento com inibidores HDAC potencializa os efeitos prejudiciais ao DNA e citotóxicos da doxorubicina em sistemas de cultura celular . É bem conhecido que o efeito colateral dose-limitante das antraciclinas é a toxicidade cardíaca irreversível devido à geração de espécies reativas de oxigênio, incluindo os prejudiciais radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio . Os cardiomiócitos são particularmente susceptíveis, dado que têm níveis relativamente baixos de ânion superóxido e de enzimas desintoxicantes do peróxido de hidrogénio, em comparação com outros tipos de células . Estudos usando respostas hipertróficas e indução de quebra de dupla cadeia de DNA como pontos finais indicaram que os inibidores de HDAC de amplo espectro, Trichostatina A, ácido valpróico e butirato de sódio, aumentam os efeitos da doxorubicina . Da mesma forma, estudos in vivo destacam as controvérsias sobre a biologia dos inibidores do HDAC no coração. Por exemplo, descobertas recentes demonstram que a Trichostatina A e o ácido valpróico protegem da hipertrofia cardíaca induzida por carga e agonistas in vivo. Entretanto, achados contrastantes indicam que a Trichostatina A piora a disfunção ventricular direita induzida pela bandagem da artéria pulmonar em ratos . Dadas essas potenciais complicações, efeitos combinatórios de inibidores HDAC mais seletivos ou específicos de isoformas com terapêutica convencional podem fornecer uma vantagem terapêutica. Neste contexto, um estudo recente identificou que o composto HDAC6-seletivo, tubacina, potencializa os efeitos da doxorubicina e etoposídeo em linhas celulares transformadas . Outras avaliações nesta direção são antecipadas.
4. Combinação de inibidores de doxorubicina Histone com radioterapia
Estudos iniciais indicaram que o ácido graxo de cadeia curta, butirato de sódio, potencia o cólon e as células cancerosas nasofaríngeas aos efeitos citotóxicos da radiação ionizante . Embora um mecanismo incomum tenha sido usado para descrever o efeito, um estudo adicional indicou que o inibidor prototípico HDAC, Trichostatin A, também aumenta a radiosensibilidade das células malignas. Outros estudos corroboraram estes resultados indicando que praticamente todos os inibidores de HDAC de amplo espectro, incluindo Trichostatina A, SAHA, depsipeptídeo, butirato de sódio, fenilbutirato, tributirina e ácido valpróico potenciam a morte celular induzida por radiação em células malignas. Em concentrações relativamente altas de inibidor de HDAC, foram observados fatores de modificação de dose (proporção de doses de radiação em células tratadas com inibidor de HDAC e células tratadas com -untreated que produzem o mesmo nível de sobrevivência) de ~2. A essas concentrações mais altas, a parada do ciclo celular (G1 e G2), inibição da síntese de DNA e indução de apoptose pelos inibidores do HDAC tem sido especulada para contabilizar o efeito sensibilizante da radiação . Em concentrações relativamente mais baixas de inibidores do HDAC, também é observado um efeito sensibilizante da radiação. Vários estudos estabeleceram uma associação entre a inibição do HDAC e as proteínas envolvidas nas cascatas de sinal em resposta a danos no DNA . Em resumo, os efeitos sensibilizantes à radiação dos inibidores do HDAC podem envolver os seguintes mecanismos. Em primeiro lugar, a hiperacetilação histonal altera a arquitetura da cromatina resultando em uma confirmação mais aberta da cromatina, que pode ser mais suscetível a danos iniciais de DNA induzidos pela radiação. Além disso, os inibidores HDAC podem interagir com as proteínas de transdução de sinal chave envolvidas nas vias de resposta ao dano do DNA. Finalmente, foi demonstrado que os inibidores HDAC regulam a transcrição dos genes envolvidos na via de reparação da dupla quebra do ADN. Por exemplo, foi demonstrado que o pré-tratamento com SAHA atenua o aumento induzido pela radiação nas proteínas de reparação do DNA Rad51 e DNA-PKcs . Da mesma forma, foi demonstrado que o butirato de sódio diminui a expressão das proteínas de reparação do DNA Ku70, Ku86 e DNA-PKcs nas linhas celulares de melanoma. Além disso, usando bleomicina, doxorubicina e etoposida para induzir quebras de DNA de dupla cadeia, avaliadas pela acumulação de focos γH2AX, foi demonstrado que os inibidores da deacetilase histônica têm como alvo a acetilação do Ku70, resultando na sensibilização .
No contexto de combinações com radioterapia, o ácido valpróico, que tem uma longa história clínica no tratamento da epilepsia, é importante . Estudos pré-clínicos indicaram que o inibidor HDAC sensibiliza as linhas celulares de glioma humano aos efeitos da radiação ionizante (raios X), tanto in vitro como in vivo . Como revisto recentemente, o ácido valpróico foi combinado com o agente alquilante temozolomida e radiação para o potencial tratamento do glioblastoma multiforme. A estratégia está atualmente sendo avaliada em um ensaio clínico fase II .
5. Efeitos Radioprotetores dos Inibidores de Deacetylase Histone
Paradoxicamente, evidências emergentes estão indicando que os inibidores HDAC possuem atividades radioprotetoras. Estudos iniciais indicaram que o pré-tratamento com fenilbutyrate oferece um modesto efeito radioprotetor em células normais humanas e cancerígenas. Outros estudos indicaram que o fenilbutirato protege da síndrome da radiação cutânea in vivo . Pensa-se que as propriedades radioprotetoras dos inibidores HDAC envolvem a repressão de citocinas inflamatórias (por exemplo, interleucina- (IL-) 1, IL-8, fator de necrose tumoral- (TNF-)α) e fatores de crescimento fibrogênicos (por exemplo, fator de crescimento transformador- (TGF-)β) . Sabe-se que estes estão envolvidos na resposta inflamatória à radiação e a secreção particular e prolongada de TNF-α e TGF-β das células epiteliais, endoteliais e do tecido conjuntivo está implicada na síndrome da radiação cutânea. Além do fenilbutirato, os inibidores de HDAC de amplo espectro Trichostatina A e ácido valpróico demonstraram proteger da lesão cutânea induzida por radiação e da letalidade induzida por radiação em camundongos. Estes efeitos também foram correlacionados com a diminuição da expressão TNF-α, TGF-β1 e TGF-β2 . Pesquisas adicionais neste sentido com o fenilbutirato indicaram que o inibidor HDAC pode proteger os ratos da letalidade aguda induzida pela radiação γ. Os efeitos foram correlacionados com uma atenuação dos danos no DNA e apoptose. Curiosamente, as administrações profiláticas e pós-irradiação do fenilbutirato permitiram a radioproteção apresentando interessantes aplicações clínicas potenciais. A profilaxia seria apropriada para radioterapia antes da exposição à radiação, e as administrações pós-irradiação seriam apropriadas em casos de exposição inadvertida à radiação.
6. Conclusões
Inibidores de HDAC surgiram como uma nova classe importante de terapêutica anticancerígena. Embora possuam potentes efeitos citotóxicos e apoptóxicos apenas, prevê-se que serão mais úteis quando utilizados em combinação com outras modalidades de câncer. Isto se reflete na maioria dos ensaios clínicos atuais que envolvem predominantemente combinações de inibidores da HDAC com quimioterápicos e radioterápicos convencionais. Uma questão importante no campo permanece sobre se os compostos seletivos de classe ou específicos de isoformas terão uma eficácia terapêutica maior do que os clássicos inibidores do HDAC de amplo espectro. Os inibidores de HDAC de largo espectro têm efeitos anticancerígenos pleiotrópicos, e isto pode ser vantajoso dada a heterogeneidade e adaptabilidade das células malignas. Por outro lado, os compostos seletivos de classe ou isoforma podem oferecer uma maior janela terapêutica com diminuição dos efeitos fora do alvo. Existe actualmente um intenso esforço de investigação com o objectivo de compreender melhor a função das enzimas HDAC, e existe uma disponibilidade crescente de compostos mais específicos. Portanto, espera-se que a questão da seletividade seja esclarecida, talvez abrindo mais oportunidades para a tradução clínica desta classe de compostos.
Conflito de Interesses
Both K. Ververis e T. C. Karagiannis declaram não ter relação financeira direta com as identidades comerciais mencionadas neste trabalho que possam levar a um conflito de interesses.
Confirmações
O apoio do Instituto Australiano de Ciência e Engenharia Nuclear é reconhecido. T. C. Karagiannis foi o ganhador dos prêmios AINSE. O Laboratório de Medicina Epigenómica é apoiado pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália. K. Ververis é apoiado por uma bolsa de pós-graduação Baker IDI. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa de Apoio à Infra-estrutura Operacional do Governo de Victoria. Os autores gostariam de agradecer o uso das instalações fornecidas pela Monash Micro Imaging na AMREP e, particularmente, a assistência especializada dos Drs. Stephen Cody e Iśka Carmichael.
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