Um Antídoto Universal de Heparina com Efeito Negligenciável sobre Fibrina(ogen) e Coagulação Plasmática

Fundos e Objetivo

Anticoagulantes desempenham um papel fundamental no tratamento de distúrbios tromboembólicos. A hemorragia em pacientes cirúrgicos que recebem anticoagulantes é uma grande preocupação. Os anticoagulantes são administrados para combater a anticoagulação e para restabelecer a hemostasia normal. Até à data, o sulfato de protamina (PS), um polipéptido catiónico, é o único antídoto clinicamente aprovado para a heparina não fracturada. A PS tem efeitos secundários tóxicos e limitações. A incapacidade da PS de reverter completamente as heparinas de baixo peso molecular e fondaparinux deve-se à sua baixa afinidade de ligação a estes medicamentos. Entretanto, a PS interage com proteínas de coagulação, como o fibrinogênio, para formar agregados que levam a efeitos adversos cardiovasculares. Recentemente, desenvolvemos um agente de reversão sintético universal da heparina (UHRA) com alta afinidade de ligação com as heparinas. Estudos in vivo revelaram que a UHRA reverte completamente a atividade de todos os anticoagulantes parentéricos clínicos disponíveis e não é tóxica. Este estudo visa demonstrar a natureza não tóxica da UHRA, avaliando sua influência no fibrinogênio, arquitetura do coágulo de fibrina, coagulação plasmática e lise do coágulo.

Métodos

UHRA foi desenvolvido incorporando grupos de ligação de heparina à base de amina terciária em um andaime hiperbranqueado de poliglicerol dendrítico e limitando-o com cadeias de metoxi polietilenoglicol. Para compreender o impacto da UHRA no sistema de coagulação, foram realizados ensaios de coagulação plasmática turbidimétrica iniciados por recalcificação e fator tecidual (TF). A interação da UHRA no fibrinogênio foi investigada através do ensaio de agregação do fibrinogênio, do ensaio de polimerização da fibrina e da análise espectroscópica (fluorescência e dicroísmo circular (DC)). A influência da UHRA na arquitetura do coágulo de fibrina foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A neutralização anticoagulante (heparinas) pela UHRA foi estudada pelo ensaio de geração de trombina fluorogênica (TGA) em plasma rico em plaquetas humanas (PRP). A lise do coágulo de plasma induzido por TF contendo UHRA ou PS exposto ao ativador de plasminogênio tecidual exógeno (t-PA) foi estudada por ensaio turbidimétrico.

Resultados e discussão

Resultados dos ensaios de coagulação plasmática mostraram que a UHRA não alterou os parâmetros de coagulação em relação à PS (tempo de defasagem iniciada por TF e absorvância máxima, controle vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 e 0,16, respectivamente; tempo de retardo e absorvância máxima na recalcificação, controle vs UHRA 200mcg/mL, p=0,08 e 0,13, respectivamente) sugerindo que a UHRA não tem efeito sobre o sistema de coagulação na concentração estudada (Figura 1). Ao contrário da protamina, a agregação de fibrinogênio e o ensaio de polimerização da fibrina não foi influenciado pela UHRA em uma ampla faixa de concentrações de 0,05mg/mL a 1mg/mL. Juntamente com as medidas de têmpera de fluorescência de triptofano (Figura 2) e as medidas da estrutura secundária do fibrinogênio corroboram que a UHRA não está interagindo com o fibrinogênio. Os resultados são bastante diferentes do PS e de outros polímeros catiônicos sintéticos que interagem com o fibrinogênio, provocando agregação e mudanças conformacionais. Coágulos de fibrina gerados na presença de UHRA (mesmo a 0,5 mg/mL) mostraram estrutura similar e o tamanho da fibra permanece igual ao coágulo de fibrina normal (controle vs UHRA 0,5 mg/mL, p= 0,12) (Figura 3). Por outro lado, coágulos de fibrina formados na presença de 0,05mg/mL de PS (dose clínica) aumentaram o tamanho da fibra e mudaram drasticamente a estrutura do coágulo (controle vs PS 0,05mg/mL coágulo, p< 0,0001). Nossos estudos de lise de coágulo plasmático na presença de t-PA exógena demonstram que a UHRA não aumentou a degradação do coágulo, ao contrário da protamina. A UHRA restaurou os níveis de trombina no PRP anticoagulado (heparinizado) demonstrando a eficácia.

Conclusão e significância

Nossos estudos demonstram que o antídoto universal de heparina, UHRA, tem impacto insignificante no fibrinogênio, na polimerização da fibrina, na estrutura do coágulo, na degradação do coágulo e no sistema de coagulação, revelando sua excelente hemocompatibilidade em comparação à protamina. Nossos resultados comprovam que a UHRA pode ser um antídoto ideal para restaurar a hemostasia após procedimentos cirúrgicos invasivos e para tratar complicações hemorrágicas por anticoagulantes à base de heparina.