Princípio do Ensaio ELISpot

Ensaios ELISpot empregam a técnica do ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche (ELISA). Um anticorpo monoclonal ou policlonal específico para o analito escolhido é pré-revestido numa microplaca revestida com PVDF (difluoreto de polivinilideno)-backed microplaca. As células adequadamente estimuladas são pipetadas para os poços e a microplaca é colocada numa incubadora de CO2 humidificada a 37 °C durante um período de tempo especificado. Durante este período de incubação, o anticorpo imobilizado, na proximidade imediata das células secretoras, liga o analito secretado. Após a lavagem de quaisquer células e substâncias não ligadas, um anticorpo policlonal biotinilado específico para a substância a analisar escolhida é adicionado aos poços. Após uma lavagem para remover qualquer anticorpo biotinilado não ligado, é adicionada uma fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina. A enzima não ligada é subsequentemente removida por lavagem e uma solução de substrato (BCIP/NBT) é adicionada. Forma-se um precipitado de cor azul-negra e aparece como manchas nos locais de localização de citocinas, com cada mancha individual representando uma célula secretora de analito individual. As manchas podem ser contadas com um sistema automático de leitura ELISpot ou manualmente, usando um estereomicroscópio.