Neutrófilo Diapedese: Paracelular ou Transcelular?

Uma das características clássicas da inflamação é a infiltração do tecido afectado por leucócitos polimorfonucleares (PMN). Para que isso ocorra, o PMN circulante deve sofrer interações adesivas com o endotélio que permitam ativá-los, achatá-los e emigrar através do revestimento endotelial dos microvasos. Os determinantes moleculares dessas interações adesivas têm sido amplamente estudados e há um consenso geral sobre a seqüência de eventos que levam ao PMN a ser colocado em posição de emigrar para o tecido (3, 12). Inicialmente, ocorre uma fraca interação adesiva entre o PMN circulante e o endotélio que resulta no movimento salino do PMN ao longo do endotélio, um fenômeno chamado de rolamento. A rolagem permite que o PMN permaneça em posição próxima ao endotélio e, se houver mediadores inflamatórios gerados localmente presentes, o PMN torna-se ativado. Uma vez ativado, o PMN forma interações adesivas mais fortes com o endotélio que levam à sua parada. Posteriormente, o PMN emigra através do endotélio. Ao contrário do caso das interações adesivas iniciais (rolagem e adesão), sobre o qual existe um consenso geral sobre os mecanismos envolvidos, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na migração transendotelial do PMN. Mesmo a premissa básica de que o PMN emigra entre células endoteliais (via paracelular) ou através das próprias células endoteliais (via transcelular) é controversa.

Consenso prevalecente sustenta que o PMN circulante emigra do compartimento intravascular para o interstício passando entre células endoteliais adjacentes, ou seja, utilizando uma via paracelular (11). Tanto estudos in vivo quanto in vitro utilizando microscopia eletrônica e leve capturaram pseudopodia migratório de PMN que se estende entre células endoteliais para passar pela barreira endotelial em resposta a um gradiente quimiotáxico. Para que o PMN possa utilizar a via paracelular para a migração transendotelial, o acoplamento adesivo entre as células endoteliais adjacentes deve ser interrompido e as células endoteliais devem se separar suficientemente umas das outras para permitir a passagem do PMN. Muitos mediadores inflamatórios usados para simular a inflamação in vitro podem, per se, induzir a formação de lacunas nas monocamadas de células endoteliais cultivadas, ou seja, a retração das células endoteliais. Entretanto, como grandes lacunas entre células endoteliais são raramente observadas em modelos de inflamação in vivo, este fenômeno pode representar um efeito exagerado de mediadores inflamatórios em sistemas in vitro. As monocamadas endoteliais cultivadas têm junções de adesão interendotelial subdesenvolvidas em comparação com suas contrapartes in vivo, e assim os mediadores inflamatórios podem produzir mais facilmente retração celular endotelial in vitro do que in vivo (12). A correlação in vivo com este fenômeno é o aumento do vazamento macromolecular entre as junções interendoteliais observado em resposta aos mediadores inflamatórios. Juntos, os estudos in vitro dão credibilidade à idéia de que as células endoteliais podem se separar umas das outras em resposta a mediadores inflamatórios, embora a extensão da separação possa ser exagerada.

Avidência de que o PMN pode induzir retração celular endotelial é primariamente derivada de estudos in vitro que abordaram os mecanismos envolvidos na lesão celular endotelial mediada por PMN (12). Esta lesão foi de natureza nãolítica e manifestou-se como descolamento de células endoteliais de monocamadas cultivadas em superfícies não porosas. Esse descolamento de célula endotelial ocorreu 3-6 h após a camada de PMN ativado na superfície de monocamadas de células endoteliais e tem sido atribuído à elastase derivada de PMN. Como as células endoteliais descoladas são raramente observadas em modelos de inflamação in vivo, o descolamento celular endotelial mediado por PMN também parece ser um exagero de um evento in vivo devido às condições experimentais impostas in vitro. Nestes sistemas (monocamadas endoteliais cultivadas em superfícies não porosas), o PMN não pode transmigrar e afastar-se da monocamada de células endoteliais. Assim, eles permanecem próximos às células endoteliais e persistem no agravamento proteolítico da monocamada, eventualmente induzindo a retração das células endoteliais e posterior descolamento. Se o PMN ativado migrar através das monocamadas de células endoteliais, a retração e descolamento das células endoteliais brutas é raramente observada.

elastase derivada do PMN pode induzir retração e descolamento das células endoteliais dentro das monocamadas. Isto é análogo ao uso de proteases para expandir as células endoteliais, ou seja, as células tratadas com protease se retraem e se descolam do substrato, mas após o tratamento com inibidores de protease, elas podem ser novamente semeadas e continuar a crescer normalmente. Curiosamente, tanto a retracção das células endoteliais como a migração transendotelial de PMN podem ser evitadas pelos inibidores da protease (por exemplo, a elastase). Estas últimas observações indicam que o PMN utiliza elastase endógena para induzir a retração das células endoteliais de magnitude suficiente para permitir a sua passagem entre as células endoteliais adjacentes sem prejudicá-las. Estudos recentes sugerem que a migração transendotelial de PMN mediada por elastase é um processo altamente regulado que não requer desgranulação de PMN (3). O PMN ativado não segrega elastase no meio extracelular, mas mobiliza elastase para a membrana e localiza-a na frente migratória, por exemplo, a pseudopodia que penetra entre células endoteliais adjacentes. Que a degranulação do PMN não é necessária para sua migração transendotelial é ainda apoiada pela observação de que os citoplastos de PMN (PMN anuclear desprovido de grânulos) migram através de monocamadas endoteliais em resposta a um gradiente quimiotáxico tão eficiente quanto o PMN normal. Novamente, a migração transendotelial dos citoplastos pode ser evitada pelos inibidores de elastase.

Células endoteliais são mantidas juntas por junções de adesão compostas de proteínas transmembranas (11). Assim, para que os neutrófilos passem entre as células endoteliais, as interações adesivas dessas junções devem ser interrompidas. Existem duas junções adesivas relevantes para a migração transendotelial de PMN: as uniões adesivas e as uniões herméticas. As junções aderentes consistem em complexos vasculares-endotelial (VE)-cadherina/catenina. A VE-cadherina tem um domínio extracelular que interage homotipicamente com a VE-cadherina nas células endoteliais adjacentes. O domínio citoplasmático da VE-cadherina associa-se com as intracelulares β- ou γ-catenins. Estes complexos de VE-cadherina/catenina estão ligados ao citoesqueleto actínico via α-catenin (Fig. 1A). As junções estreitas consistem em múltiplas proteínas transmembranas, incluindo a oclusina e as claudinas 1 e 2, e proteínas intracelulares associadas, como ZO-1, -2 e -3, que ligam as proteínas da junção estreita ao citoesqueleto. Destas duas junções de adesão, o efeito da migração transendotelial de PMN nas junções aderentes tem recebido a maior atenção.

Estudos recentes usando microscopia confocal indicam que interações adesivas do PMN (adesão e migração transendotelial) podem resultar em ruptura local das proteínas de junção dos aderentes (10). Duas populações de PMN foram capturadas aderindo a monocamadas de células endoteliais: 1) aquelas abaixo das quais não houve interrupção da continuidade das proteínas de junção dos aderentes e 2) aquelas abaixo das quais houve interrupção das proteínas de junção dos aderentes. A disrupção da continuidade da junção dos aderentes por PMN aderente foi um fenómeno local, uma vez que as junções dos aderentes mais afastadas do PMN não foram afectadas. Uma análise sistemática revelou que as proteínas de junção dos aderentes por baixo do PMN aderente foram afectadas sequencialmente, ou seja, o β-catenin foi perdido antes do VE-cadherin. Os PMN capturados no processo de migração transendotelial foram invariavelmente associados à perda de todas as proteínas de junção aderentes no local da migração. Novamente, não houve efeito na integridade da junção dos aderentes em locais mais afastados do PMN migrante. Além disso, as evidências da importância da ruptura da junção dos aderentes na migração transendotelial de PMN incluem o seguinte: 1) in vivo, os anticorpos contra a emigração de PMN de EM-caderina aumentaram a migração de PMN, e 2) in vitro, os anticorpos contra a migração transendotelial de EM-caderina aumentaram a migração de PMN e induziram a reorganização do citoesqueleto de actina endotelial, resultando na formação de lacunas entre as células endoteliais.

No que diz respeito aos complexos de junção apertada, estudos recentes fizeram observações semelhantes. A migração transendotelial de PMN perturbou a continuidade ZO-1 e -2 somente no local de penetração do PMN nas junções interendoteliais (1). Descontinuidades generalizadas nas junções estreitas não foram observadas.

Mecanismos potenciais envolvidos na diapedese paracelular

O mecanismo pelo qual as interações adesivas entre o PMN e a célula endotelial perturbam a junção aderente não é claro. Uma possibilidade é que o PMN aderente utilize proteases endógenas para degradar as proteínas de junção dos aderentes (Fig. 1A). Por exemplo, os inibidores de elastase foram capazes de diminuir a extensão da perda induzida pelo PMN das proteínas de junção aderentes VE-cadherin e β-catenin (2). Outros estudos (11) indicam que o PMN ativado pode degradar a VE-cadherina e que um inibidor de elastase pode prevenir essa degradação. Além disso, a elastase neutrofílica purificada produz produtos de degradação da VE-cadherina semelhantes aos observados após a degradação deste componente de junção aderente pelo PMN ativado. Juntos, parece provável que a elastase derivada de PMN desempenhe um papel na ruptura da junção dos aderentes.

Interações adesivas entre células endoteliais PMN também poderiam sinalizar as células endoteliais a participar ativamente na migração transendotelial de PMN separando-se umas das outras, ou seja, a formação de fenda interendotelial (Fig. 1A). Esta contenção é apoiada pelas seguintes linhas de evidência. O PMN aderente pode induzir aumentos nos níveis de Ca2+ da célula endotelial e a quelação deste Ca2+ resulta numa inibição da migração transendotelial do PMN. Além disso, a inibição da miosina quinase da cadeia leve da miosina endotelial (um determinante chave da formação de um intervalo interendotelial de células) reduziu a migração transendotelial de PMN (11). Finalmente, como já foi apontado, o PMN aderente afeta a intracelular β-catenin antes da membrana plasmática VE-cadherina. Juntas, essas observações indicam que células endoteliais podem ser induzidas a participar ativamente na migração transendotelial do PMN retraindo-se umas das outras.

Evidência em favor da diapedese transcelular

Muitos relatos iniciais e mais recentes que examinaram a diapedese leucocitária in vivo usando uma abordagem ultra-estrutural indicam que a maioria dos PMNs sai da transcelularidade da vasculatura, ou seja através de poros ou passagens que atravessam o citoplasma endotelial. O exame dos cortes em série usando microscopia eletrônica de transmissão sugere que os PMNs podem migrar através de regiões que não estão associadas a junções células-células identificáveis (4, 5, 8). Tem sido argumentado que mesmo a secção em série não fornece inequivocamente provas de que uma junção célula-célula não estava próxima, mas sim que pode ter sido perdida. Além disso, pode ser difícil identificar junções aderentes densas de elétrons, particularmente nas regiões em que o endotélio é <0,5 μm em altura. Finalmente, dados in vitro recentes indicam que as junções células aderentes se desmontam molecularmente durante a diapedese de PMN (10) e, portanto, não se esperaria vê-las morfologicamente.

Scanning electron microscopy images provide more compelling evidence that PMNs penetrate endothelial cells through openings that are not associated with endothelial cell-cell contacts (4, 9). Os PMNs que estão em processo de diapedese parecem ter uma forma de haltere, com uma constrição na região ao nível do endotélio (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Dependendo de quão longe a diapedese progrediu, uma extensão em forma de bolha é vista ou protuberante para a luz do vaso ou estendendo-se para o interstício (5, 9, 11, 15). Isto indica que os leucócitos estão espremendo através de um poro circular de diâmetro pequeno e limitado, ao invés de induzir a retração das células endoteliais individuais umas das outras. A célula endotelial e o leucócito permanecem em estreito contato durante toda a diapedese. O endotélio frequentemente parece se espalhar ao longo do lado luminal da superfície do PMN para envolvê-lo completamente, fechando assim o espaço luminal antes que o PMN seja liberado na matriz tecidual (4, 5, 8). Este processo tem sido frequentemente observado durante a emigração in vivo, mas não foi demonstrado que ocorra durante a migração transendotelial in vitro.

Mecanismos potenciais envolvidos na diapedese transcelular

Embora seja difícil aplicar abordagens mecanicistas rigorosas em estudos in vivo, há evidências circunstanciais suficientes para suportar vários mecanismos possíveis pelos quais o PMN emigra transcelularmente. É concebível que os poros transcelulares através dos quais o PMN migra sejam resultado de danos proteolíticos ao endotélio. Entretanto, tem sido apontado que, pelo menos ultra-estruturalmente, o endotélio permanece intacto e continua a formar cavernas e vesículas endocitóticas mesmo em regiões de membrana que estão em estreito contato com o PMN (13). É mais provável que o PMN, que parece migrar por curtas distâncias ao longo da superfície endotelial apical, procure regiões finas do endotélio, como a fenestrae. As fenestras podem ser abertas (50 nm de diâmetro) ou subtendidas por um diafragma a espessura de duas membranas plasmáticas (desprovidas de citoplasma). Assim, o PMN pode passar facilmente através de fenestras abertas ou proteolíticamente através de fenestras com diafragma, sem danificar o endotélio propriamente dito. A fenestrae pode representar um caminho importante para a emigração do PMN nos órgãos que contêm microvasos fenestrados (por exemplo, mucosa gastrointestinal, glândulas secretoras).

Em órgãos contendo microvasos contínuos (por exemplo, pele, músculo), o PMN pode usar cavernas ou vesículas pinocitóticas e inserir nelas filopódios para penetrar a barreira endotelial. Acredita-se que estas estruturas, entre 50 e 100 nm de diâmetro, mediem o transporte de proteínas através do endotélio e fornecem uma via extrajuncional para o vazamento de proteínas vasculares durante a inflamação. Recentemente, foi demonstrado que as cavernas formam organelas vesicovacuolares, que podem formar pequenas passagens contínuas de membrana através do citoplasma de uma célula endotelial (6). Foi demonstrado que a formação de tais cavernas e vesículas continua em regiões da membrana superficial endotelial que estão em contato com PMNs aderentes (13). Além disso, os PMNs que aderem de perto à superfície da célula endotelial frequentemente estendem filópodos semelhantes a dedos em indentações na membrana plasmática apical, remodelando assim a superfície endotelial (4, 7, 8). A força protrusiva de um filopódio aderente para formar organelas vesicovacuolares pode levar ao surgimento desse filopódio no lado endotelial abluminal (Fig. 1B), onde ele pode prontamente interagir com a matriz extracelular e se espalhar ao longo dela (Fig. 1B).

Uma concentração de F-actin e microfilamentos em pseudopodia de PMN foi demonstrada durante a diapedese in vivo (15) e in vitro (3) e pode gerar a força necessária para puxar os processos celulares em avanço através dos poros transcelulares. Os poros podem se alargar até um tamanho de 3-5 μm, através do qual o leucócito pode facilmente atravessar. Este alargamento do poro vacuolar inicial pode ser realizado em parte por forças geradas pela tensão no sistema de microfilamento cortical presente na parte esférica do leucócito que ainda se projeta para a luz do vaso. De fato, uma concentração de F-actin na região caudal de PMN transmigrantes tem sido observada durante os estágios tardios da diapedese (15). Além disso, o rearranjo citoesquelético no citoplasma endotelial pode auxiliar no alargamento do poro transendotelial, como já foi sugerido anteriormente (14). O processo de formação dos poros seria acompanhado por um alargamento das regiões apicais da membrana endotelial ao longo da superfície celular do PMN, levando ao eventual engolfamento das porções luminosas do PMN pelo endotélio, como tem sido demonstrado em micrografias eletrônicas (Fig. 1B). Esta participação ativa do endotélio ajudaria na rápida resselagem do revestimento endotelial, limitando assim o vazamento de proteína.

Sumário

Desta revisão das evidências, fica aparente que o PMN pode utilizar tanto as vias paracelulares quanto transcelulares para atravessar a barreira endotelial durante a inflamação. Vale ressaltar que a migração transendotelial de PMN in vitro favorece a via paracelular, enquanto a migração transendotelial de PMN in vivo favorece a via transcelular. Se um supõe teleologicamente que o PMN transmigrador escolherá o caminho de menor resistência, então pode haver uma explicação para a aparente discrepância entre os resultados obtidos usando abordagens in vitro e in vivo.

Em monocamadas de células endoteliais cultivadas em cultura, as regiões mais atenuadas são próximas às junções células-células, e não é, portanto, surpreendente que este seja o local preferido onde ocorre a diapedese. Além disso, nas células endoteliais cultivadas, as junções intercelulares são estruturas instáveis que estão sendo constantemente desmontadas e remontadas. Tal região seria facilmente acessível pela pseudopodia dos leucócitos transmigradores. Há também evidências de que, mesmo in vitro, a via paracelular utilizada pelo PMN durante a diapedese é especificamente selecionada, ou seja, a diapedese ocorre preferencialmente nos cantos tricelulares e não entre duas células endoteliais (1). As junções aderentes e as junções estreitas são descontínuas nesses cantos tricelulares, apresentando assim o trajeto de menor resistência para o PMN transmigrador. Em contraste, as junções interendoteliais estão muito mais desenvolvidas in vivo e são mais resistentes ao movimento proteico através delas. Assim, o PMN pode utilizar preferencialmente poros na região fina das células endoteliais, como fenestrae ou caveolae, como caminho de menor resistência.

Atribuir o caminho preferencial (paracelular vs. transcelular) utilizado pelo PMN durante a diapedese ao fato de serem utilizadas abordagens in vitro ou in vivo para estudar este fenômeno é, notadamente, uma simplificação excessiva. Há muitos exemplos de desvios a este paradigma. Por exemplo, há evidências indicando que o PMN pode utilizar a via paracelular in vivo e a via transcelular in vitro. Além disso, se a via transcelular é a preferencial para a diapedese in vivo do PMN, por que a interferência com as proteínas juncionais altera drasticamente a diapedese do PMN in vivo? Pode muito bem ser que este argumento persista durante anos, tal como o argumento sobre se o movimento da proteína transendotelial ocorre preferencialmente através da via paracelular ou da via transcelular. Pode-se prever que os argumentos a respeito da rota de migração transendotelial do PMN podem, em parte, ser atribuídos à natureza da resposta inflamatória ou à natureza do leito vascular em que ela ocorre. Espera-se que estudos adicionais forneçam informações adicionais que permitam a resolução desta controvérsia.