Junção de Holliday

Os dois caminhos para a recombinação homóloga em eucariotas, mostrando a formação e resolução das junções de Holliday

A junção de Holliday é um intermediário chave na recombinação homóloga, um processo biológico que aumenta a diversidade genética através da mudança de genes entre dois cromossomas, bem como eventos de recombinação específicos do local envolvendo integrases. Além disso, eles estão envolvidos na reparação de quebras de dupla cadeia. Além disso, estruturas cruciformes envolvendo junções de Holliday podem surgir para aliviar a tensão helicoidal em sequências simétricas em super bobinas de DNA. Enquanto as junções de quatro braços também aparecem em moléculas funcionais de RNA, tais como o RNA spliceosomal U1 e a ribozima do vírus da mancha anelar do tabaco, estas geralmente contêm nucleotídeos não pareados entre os domínios emparelhados de dupla camada, e assim não adotam estritamente a estrutura de Holliday.

As junções de Holliday em recombinação homóloga estão entre sequências idênticas ou quase idênticas, levando a um arranjo simétrico de sequências em torno da junção central. Isto permite que ocorra um processo de migração de ramos onde os fios se movem através do ponto de junção. A clivagem, ou resolução, da junção de Holliday pode ocorrer de duas maneiras. A clivagem do conjunto original de cordões leva a duas moléculas que podem mostrar conversão gênica, mas não o cruzamento cromossômico, enquanto a clivagem do outro conjunto de dois cordões faz com que as moléculas recombinantes resultantes mostrem cruzamento. Todos os produtos, independentemente da clivagem, são heterodúplexos na região da migração da junção de Holliday.

Muitas proteínas são capazes de reconhecer ou distorcer a estrutura da junção de Holliday. Uma dessas classes contém enzimas que resolvem as junções, por vezes de uma forma específica de sequência. Tais proteínas distorcem a estrutura da junção de várias maneiras, muitas vezes puxando a junção para uma conformação desempilhada, quebrando os pares de bases centrais, e/ou mudando os ângulos entre os quatro braços. Outras classes são proteínas de migração de ramos que aumentam a taxa de câmbio por ordens de magnitude, e recombinases específicas do local. Em procariotas, as recombinações de junção de Holliday dividem-se em duas famílias, integrases e nucleases, cada uma estruturalmente semelhante, embora suas seqüências não sejam conservadas.

Em eucariotas, dois modelos primários de como as recombinações homólogas reparam as quebras de dupla cadeia no DNA são a via de reparação de quebra de dupla cadeia (DSBR) (às vezes chamada de modelo de junção de dupla cadeia de Holliday) e a via de recozimento de cadeia dependente da síntese (SDSA). No caso de quebra de fio duplo, a extremidade de 3′ é degradada e a extremidade mais longa de 5′ invade a cromatídeo irmão contíguo, formando uma bolha de replicação. Quando esta bolha se aproxima do DNA quebrado, o fio mais longo de 5′ antisense invade novamente o fio de sentido desta porção de DNA, transcrevendo uma segunda cópia. Quando a replicação termina, ambas as caudas são reconectadas para formar duas Holliday Junctions, que são então clivadas em uma variedade de padrões por proteínas. Uma animação deste processo pode ser vista aqui.

Quebras de DNA de dupla cadeia em bactérias são reparadas pelo caminho de recombinação homóloga RecBCD. As quebras que ocorrem em apenas uma das duas cadeias de DNA, conhecidas como fissuras de uma só cadeia, são pensadas para serem reparadas pela via RecF. Tanto as vias RecBCD como RecF incluem uma série de reacções conhecidas como migração de ramos, em que cordões de ADN únicos são trocados entre duas moléculas de ADN duplex intercruzadas, e resolução, em que essas duas moléculas de ADN intercruzadas são cortadas e restauradas ao seu estado normal de dupla cadeia. A recombinação homóloga ocorre em vários grupos de vírus. Em vírus de DNA como o herpesvírus, a recombinação ocorre através de um mecanismo de quebra e junção, como em bactérias e eucariotas. Em bactérias, a migração de ramos é facilitada pelo complexo RuvABC ou proteína RecG, motores moleculares que utilizam a energia da hidrólise de ATP para mover a junção. A junção deve então ser resolvida em dois duplex separados, restaurando ou a configuração dos pais ou uma configuração cruzada. A resolução pode ocorrer de forma horizontal ou vertical durante a recombinação homóloga, dando produtos patch (se na mesma orientação durante o reparo de quebra dupla de fio) ou produtos splice (se em orientações diferentes durante o reparo de quebra dupla de fio). RuvA e RuvB são proteínas de migração de ramo, enquanto RuvC é uma enzima que resolve junções.

Há evidências de recombinação em alguns vírus RNA, especificamente vírus ssRNA de sentido positivo como retrovírus, picornavírus e coronavírus. Há controvérsia sobre se a recombinação homóloga ocorre em vírus ssRNA de sentido negativo como o influenza.

ResolutionEdit

Na levedura de brotação Saccharomyces cerevisiae, os cruzamentos de Holliday podem ser resolvidos por quatro caminhos diferentes que respondem essencialmente por todos os cruzamentos de Holliday com resolução in vivo. O caminho que produz a maioria dos crossovers em S. cerevisiae, e possivelmente em mamíferos, envolve proteínas EXO1, MLH1-MLH3 heterodímero (chamado MutL gamma) e SGS1 (ortolog do helicóptero com síndrome de Bloom). O heterodímero MLH1-MLH3 liga-se preferencialmente às junções de Holliday. É um endonuclease que faz quebras de uma só corda em ADN super enrolado de dupla corda. O heterodímero MLH1-MLH3 promove a formação de recombinantes de crossover. Enquanto as outras três vias, envolvendo as proteínas MUS81-MMS4, SLX1 e YEN1, respectivamente, podem promover a resolução da junção de Holliday in vivo, a ausência dos três nucleases tem apenas um impacto modesto na formação de produtos cruzados.

Muitos mutantes eliminados tanto para MLH3 (caminho principal) quanto para MMS4 (caminho menor) mostraram uma travessia dramaticamente reduzida em comparação com o tipo selvagem (6 a 17 vezes); entretanto, a viabilidade dos esporos era razoavelmente alta (62%) e a disjunção cromossômica parecia ser mais funcional.

Embora o MUS81 seja um componente de uma via de cruzamento menor na meiose da levedura, plantas e vertebrados, no protozoário Tetrahymena thermophila, o MUS81 parece ser parte de uma via de cruzamento essencial, se não a via predominante. A via MUS81 também parece ser a via de cruzamento predominante na levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe.

As proteínas MSH4 e MSH5 formam uma estrutura hetero-oligomérica (heterodímero) em leveduras e humanos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae MSH4 e MSH5 actuam especificamente para facilitar o cruzamento entre cromossomas homólogos durante a meiose. O complexo MSH4/MSH5 liga e estabiliza as duplas junções Holliday e promove a sua resolução em produtos cruzados. Um MSH4 hipomórfico (parcialmente funcional) mutante de S. cerevisiae mostrou uma redução de 30% no número de cromossomos cruzados, e um grande número de meias com cromossomos sem troca. No entanto, este mutante deu origem a padrões de viabilidade de esporos sugerindo que a segregação dos cromossomos não cambiáveis ocorreu de forma eficiente. Assim, em S. cerevisiae a segregação adequada aparentemente não depende inteiramente de cruzamentos entre pares homólogos.