Introdução à Deconvolução

Deconvolução é uma técnica de processamento de imagem computacionalmente intensiva que está sendo cada vez mais utilizada para melhorar o contraste e a resolução das imagens digitais capturadas no microscópio. As bases são baseadas em um conjunto de métodos que são projetados para remover ou reverter o embaçamento presente nas imagens do microscópio induzido pela abertura limitada da objetiva.

Inicialmente qualquer imagem adquirida em um microscópio de fluorescência digital pode ser desconvoluida, e várias novas aplicações estão sendo desenvolvidas que aplicam técnicas de deconvolução a imagens de luz transmitida coletadas sob uma variedade de estratégias de realce de contraste. Entre os temas mais adequados para melhoria por deconvolução estão as montagens tridimensionais construídas a partir de uma série de seções ópticas.

Os conceitos básicos que envolvem a aquisição de imagens da série z para análise de deconvolução são apresentados com um diagrama esquemático na Figura 1. Uma série de imagens são registradas da amostra, cada uma ligeiramente deslocada uma da outra ao longo do eixo z. Esta alteração no plano focal resulta numa imagem ligeiramente diferente, com alterações subtis causadas pela luz fora de foco vinda de cima e de baixo do plano z actual. Durante a análise de deconvolução, a série z inteira é analisada para criar um conjunto de dados mais claro e de maior resolução que não seja convoluído pela fluorescência fora de foco.

Deconvolução é frequentemente sugerida como uma boa alternativa ao microscópio confocal, já que ambas as técnicas procuram minimizar o efeito da fluorescência fora de foco na sua imagem final. Isto não é estritamente verdade porque as imagens adquiridas usando uma abertura de orifício em um microscópio confocal se beneficiam do processamento de deconvolução. O microscópio confocal impede que a luz fora de foco seja detectada ao colocar uma abertura de orifício entre a objetiva e o detector, através da qual somente em raios de luz de foco podem passar. Em contraste, os microscópios de amplo campo permitem que a luz fora de foco passe diretamente para o detector. A deconvolução é então aplicada às imagens resultantes para subtrair a luz fora de foco ou redireccioná-la para a sua fonte. A microscopia confocal é especialmente adequada para examinar amostras espessas, como embriões ou tussues, enquanto o processamento de deconvolução de amplo campo provou ser uma ferramenta poderosa para a obtenção de imagens de amostras que requerem níveis de luz extremamente baixos. Essas ferramentas podem até ser combinadas para reduzir o ruído em imagens adquiridas em um microscópio confocal. Entretanto, a maioria dos experimentos de deconvolução relatados na literatura se aplica a imagens gravadas em um microscópio padrão de fluorescência de amplo rendimento.

Fontes de degradação de imagem

Cam de degradação de imagem ser dividida em quatro fontes independentes: ruído, dispersão, ofuscamento e embaçamento. A Figura 2 apresenta exemplos do impacto visual de cada uma destas na mesma imagem.

O ruído pode ser descrito como uma quase desarranjo de detalhes em uma imagem, que (na sua forma mais severa) tem a aparência de ruído branco ou ruído de sal e pimenta, semelhante ao que é visto na televisão radiodifundida quando experimenta má recepção (Figura 2(a)). Este tipo de ruído é referido como “quasi-random” porque a distribuição estatística pode ser prevista se a mecânica da fonte for conhecida. Na microscopia digital, a principal fonte de ruído é o próprio sinal (frequentemente referido como ruído de disparo de fotões) ou o sistema de imagem digital. A mecânica de ambas as fontes de ruído é compreendida e, portanto, a distribuição estatística do ruído é conhecida. O ruído dependente do sinal pode ser caracterizado por uma distribuição de Poisson, enquanto o ruído proveniente do sistema de imagem muitas vezes segue uma distribuição Gaussiana. Como a fonte e distribuição de ruído comum em magos digitais é tão bem compreendida, ela pode ser facilmente removida pela aplicação dos filtros de imagem apropriados, que são geralmente incluídos na maioria dos pacotes de software de deconvolução como uma rotina opcional de “pré-processamento”.

Scatter é geralmente referida como um distúrbio aleatório de luz induzido por alterações no índice de refração ao longo de um espécime. O efeito líquido da dispersão é uma verdadeira desarranjo aleatório dos detalhes da imagem, como manifestado na Figura 2(b). Embora nenhum método completamente satisfatório tenha sido desenvolvido para prever a dispersão em uma determinada amostra, foi demonstrado que o grau de dispersão é altamente dependente da espessura da amostra e das propriedades ópticas da amostra e dos materiais de embutimento circundantes. A dispersão aumenta tanto com a espessura da amostra como com a heterogeneidade do índice de refração apresentado pelos componentes internos dentro de uma amostra.

Similar à dispersão, o brilho é um distúrbio aleatório da luz, mas ocorre nos elementos ópticos (lentes, filtros, prismas, etc.) do microscópio e não dentro da amostra. O nível de brilho em um microscópio moderno foi minimizado pelo emprego de lentes e filtros com revestimentos anti-reflexo, e pelo refinamento das técnicas de formação de lentes, cimentos ópticos e formulações de vidro. A Figura 2(c) ilustra o efeito do brilho descontrolado.

Blur é descrito por uma propagação da luz não controlada que ocorre pela passagem através do caminho óptico do sistema de imagem (Figura 2(d)). A fonte mais significativa de embaçamento é a difração, e uma imagem cuja resolução é limitada apenas pelo embaçamento é considerada como limitada pela difração. Isso representa um limite intrínseco de qualquer sistema de imagem e é o fator determinante na avaliação do limite de resolução de um sistema óptico. Felizmente, modelos sofisticados de desfocagem em um microscópio ótico estão disponíveis que podem ser utilizados para determinar a fonte dos fótons fora de foco. Esta é a base para a deconvolução. Devido à sua importância fundamental na deconvolução, o modelo teórico de desfocagem será discutido com muito mais detalhes em outras partes desta seção. Entretanto, deve ser enfatizado que todos os sistemas de imagem produzem borrão independentemente das outras formas de degradação de imagem induzida pelo espécime ou pela eletrônica instrumental que o acompanha. É precisamente essa independência do desfoque óptico de outros tipos de degradação que permite a possibilidade de remoção do desfoque por técnicas de desconvolução.

A interação da luz com a matéria é a origem física primária da dispersão, do ofuscamento e do desfoque. Entretanto, a composição e disposição das moléculas em um determinado material (seja vidro, água ou proteína) confere a cada material o seu próprio conjunto particular de propriedades ópticas. Para fins de desconvolução, o que distingue a dispersão, o brilho e o embaçamento são o local onde eles ocorrem e a possibilidade de gerar um modelo matemático para esses fenômenos. Como a dispersão é um fenômeno localizado e irregular que ocorre no espécime, tem se mostrado difícil de modelar. Em contraste, como o embaçamento é uma função do sistema óptico do microscópio (principalmente o objetivo), ele pode ser modelado com relativa simplicidade. Tal modelo torna possível reverter matematicamente o processo de desfocagem, e a desconvolução emprega este modelo para reverter ou remover o borrão.

A Função de Propagação do Ponto

O modelo para o borrão que evoluiu na óptica teórica é baseado no conceito de uma função tridimensional de dispersão do ponto (FPS). Este conceito é de fundamental importância para a deconvolução e deve ser claramente compreendido de modo a evitar artefatos de imagem. A função de espalhamento pontual baseia-se numa fonte de luz pontual infinitamente pequena com origem no espaço do espécime (objecto). Como o sistema de imagem microscópica recolhe apenas uma fração da luz emitida por este ponto, ele não pode focalizar a luz em uma imagem tridimensional perfeita do ponto. Em vez disso, o ponto aparece ampliado e espalhado em um padrão de difração tridimensional. Assim, a função de propagação do ponto é formalmente definida como o padrão de difração tridimensional gerado por uma fonte de luz ideal do ponto.

Dependente do modo de imagem que está sendo utilizado (widefield, confocal, luz transmitida), a função de propagação do ponto tem uma forma e um contorno diferentes e únicos. Em um microscópio de fluorescência de amplo campo, a forma da função de espalhamento de pontos se assemelha à de uma “bola de futebol” oblonga de luz cercada por um clarão de anéis de alargamento. Para descrever a função de espalhamento de pontos em três dimensões, é comum aplicar um sistema de coordenadas de três eixos (x, y e z) onde × e y são paralelos ao plano focal da amostra e z é paralelo ao eixo óptico do microscópio. Neste caso, a função de espalhamento de pontos aparece como um conjunto de anéis concêntricos no plano x-y, e assemelha-se a uma ampulheta nos planos x-z e y-z (como ilustrado na Figura 3). Uma fatia x-y através do centro da função de espalhamento do ponto largo revela um conjunto de anéis concêntricos: o chamado disco Airy que é comumente referenciado em textos sobre microscopia óptica clássica.

Duas projeções x-z de funções de espalhamento do ponto mostrando diferentes graus de aberração esférica são apresentadas na Figura 3. O eixo óptico é paralelo ao eixo vertical da imagem. A função de espalhamento de pontos à esquerda mostra uma aberração esférica mínima, enquanto que à direita mostra um grau significativo de aberração. Note que a assimetria axial e o alargamento do nó central ao longo do eixo óptico na imagem à direita leva a uma resolução axial degradada e a um embaçamento do sinal. Em teoria, o tamanho da função de propagação do ponto é infinito, e a intensidade total da soma da luz em planos distantes do foco é igual à intensidade somada no foco. No entanto, a intensidade da luz cai rapidamente e eventualmente torna-se indistinguível do ruído. Em uma função de espalhamento de ponto não calibrada registrada com uma alta abertura numérica (1,40) objetiva de imersão em óleo, a luz ocupando 0,2 micrômetros quadrados no plano de foco é espalhada em 90 vezes aquela área a 1 micrômetro acima e abaixo do foco. A amostra utilizada para registrar estas imagens da função de propagação pontual foi uma conta fluorescente de 0,1 micrômetros de diâmetro montada em glicerol (índice de refração igual a 1,47), com os óleos de imersão tendo os índices de refração anotados na figura.

Uma consideração importante é como a função de propagação pontual afeta a formação da imagem no microscópio. O modelo teórico de formação da imagem trata a função de dispersão de pontos como a unidade básica de uma imagem. Em outras palavras, a função de espalhamento de pontos é para a imagem o que o tijolo é para a casa. O melhor que uma imagem pode ser é uma montagem de funções de espalhamento de pontos, e aumentar a ampliação não mudará este fato. Como um notável livro teórico de óptica (Born and Wolf: Principles of Optics) explica, “É impossível trazer à tona detalhes não presentes na imagem primária aumentando a potência da ocular, pois cada elemento da imagem primária é um pequeno padrão de difração, e a imagem real, como vista pela ocular, é apenas o conjunto das imagens ampliadas destes padrões”.

Como exemplo, considere uma população de contas fluorescentes de subresolução ensanduichadas entre uma lamela e uma lâmina de microscópio. Uma imagem in-focus desta amostra revela uma nuvem de pontos, que na verdade é um disco rodeado por um conjunto minúsculo de anéis (na verdade, um disco Airy; ver Figura 4(a)). Se este espécime for ligeiramente removido do foco, um conjunto maior de anéis concêntricos aparecerá onde cada ponto estava na imagem focada (Figura 4(b)). Quando uma imagem tridimensional deste espécime é recolhida, então uma função completa de espalhamento de pontos é gravada para cada conta. A função de espalhamento de pontos descreve o que acontece com cada fonte de luz pontual depois que ela passa pelo sistema de imagem.

O processo de desfocagem descrito é matematicamente modelado como uma convolução. A operação de convolução descreve a aplicação da função de espalhamento de pontos para cada ponto da amostra: a luz emitida a partir de cada ponto do objeto é girada com a função de espalhamento de pontos para produzir a imagem final. Infelizmente, esta convolução faz com que pontos no espécime se tornem regiões borradas na imagem. O brilho de cada ponto da imagem está linearmente relacionado pela operação de convolução com a fluorescência de cada ponto da amostra. Como a função de espalhamento de pontos é tridimensional, o embaçamento a partir da função de espalhamento de pontos é um fenômeno inerentemente tridimensional. A imagem de qualquer plano focal contém luz embaçada de pontos localizados nesse plano misturada com luz embaçada de pontos originários de outros planos focais.

A situação pode ser resumida com a ideia de que a imagem é formada por uma convolução da amostra com a função de espalhamento de pontos. A deconvolução inverte este processo e tenta reconstruir a amostra a partir de uma imagem desfocada.

Aberrações na Função de espalhamento de pontos

A função de espalhamento de pontos pode ser definida teoricamente utilizando um modelo matemático de difração, ou empiricamente adquirindo uma imagem tridimensional de um talão fluorescente (ver Figura 3). Uma função de espalhamento teórico tem geralmente simetria axial e radial. Com efeito, a função de espalhamento do ponto é simétrica acima e abaixo do plano x-y (simetria axial) e rotacionalmente sobre o eixo z (simetria radial). Uma função de espalhamento do ponto empírico pode desviar-se significativamente da simetria perfeita (como apresentado na Figura 3). Este desvio, mais comumente referido como aberração, é produzido por irregularidades ou desalinhamentos em qualquer componente do trem óptico do sistema de imagem, especialmente a objetiva, mas também pode ocorrer com outros componentes como espelhos, feixes divisores, lentes tubulares, filtros, diafragmas e aberturas. Quanto mais alta a qualidade dos componentes ópticos e melhor o alinhamento do microscópio, mais próxima a função de espalhamento do ponto empírico chega à sua forma simétrica ideal. Tanto a microscopia confocal como a de desconvolução dependem de a função de espalhamento do ponto estar o mais próximo possível do caso ideal.

A aberração mais comum encontrada na microscopia óptica, bem conhecida por qualquer microscopista experiente e profissional, é a aberração esférica. A manifestação desta aberração é uma assimetria axial na forma da função de espalhamento do ponto, com um aumento correspondente no tamanho, particularmente ao longo do eixo z (Figura 3). O resultado é uma considerável perda de resolução e intensidade do sinal. Na prática, a fonte típica de aberração esférica é um desajuste entre os índices de refração do meio de imersão da lente frontal objetiva e o meio de montagem no qual o espécime é banhado. Uma ênfase tremenda deve ser colocada na importância de minimizar esta aberração. Embora a deconvolução possa restaurar parcialmente a resolução perdida, nenhuma quantidade de processamento de imagem pode restaurar o sinal perdido.