Importância Clínica dos Receptores Canabinoides CB1 e CB2 Expressão em Lesões Malignas e Benignas da Tiróide Humana
Abstract
O sistema endocanabinoide é composto por receptores canabinoides (CB1 e CB2), seus ligantes endógenos (endocanabinóides), e as proteínas responsáveis pelo seu metabolismo participam em muitas funções diferentes indispensáveis à regulação homeostática em vários tecidos, exercendo também efeitos antitumorigénicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o significado clínico da expressão de CB1 e CB2 nas lesões benignas e malignas da tireóide humana. A expressão das proteínas CB1 e CB2 foi avaliada imunohistoquimicamente em tecidos tireoidianos com inclusão de parafina obtidos de 87 pacientes com lesões benignas e malignas e foi analisada estatisticamente com parâmetros clínico-patológicos, capacidade proliferativa das células foliculares e risco de recorrência estimado de acordo com o sistema de estadiamento da American Thyroid Association (ATA). A expressão melhorada de CB1 e CB2 foi significativamente mais frequentemente observada em lesões malignas em comparação com lesões benignas da tireóide ( e , resp.). A expressão melhorada de CB1 e CB2 também foi significativamente mais frequentemente observada em carcinomas papilares em comparação com nódulos hiperplásicos ( e , resp.). Nas lesões malignas da tireóide, a expressão elevada de CB2 foi significativamente associada à presença de metástases linfonodais. A expressão elevada de CB2 também foi observada com maior freqüência em casos de tireóide maligna com presença de capsular, linfática e invasão vascular, assim como naqueles com maior risco de recorrência, a um nível não significativo, enquanto a expressão de CB1 não foi associada a nenhum dos parâmetros clinicopatológicos examinados. Nossos dados sugerem que os receptores CB podem estar envolvidos na transformação maligna da tireóide e especialmente o receptor CB2 poderia servir como biomarcador útil e alvo terapêutico potencial na neoplasia da tireóide.
1. Introdução
Sistema endocannabinoide (ECS) é um sistema endógeno indutor de sinal lipídico, presente em vários tecidos humanos, que exerce muitas funções diferentes e não relacionadas. Estudos substanciais têm indicado os efeitos regulatórios do ECS sobre o sistema nervoso central e periférico, o trato gastrointestinal e o sistema imunológico, estando envolvido em múltiplos processos, tais como motilidade gastrointestinal, humor, regulação da dor, memória e apetite . Estas funções são desencadeadas pela ligação de ligandos endógenos e exógenos a receptores canabinoides (receptores CB). Além dessas funções bem conhecidas, a ECS também exerce efeitos antiproliferativos através da modulação de várias vias de sinalização, enquanto sua ativação pode ter significado prognóstico para a progressão do desenvolvimento tumoral .
Existem dois subtipos de receptores CB, com diferente distribuição entre os tecidos humanos. O receptor CB1 está localizado principalmente no sistema nervoso central, adipócitos, fígado, pâncreas, músculo esquelético e linfócitos T. O receptor CB2 é detectado principalmente em células imunes, mas também em neurônios e outras células que compõem o sistema nervoso central, como as astrócitos e microglia, bem como em células endoteliais cerebromicrovasculares. A ativação dos receptores CB inibe a formação de AMPc através do seu acoplamento às proteínas Gi, resultando na diminuição da proteína cinase A- (PKA-) dependente da fosforilação. Os receptores CB também se acoplam à cinase extracelular de sinal regulado (ERK) e especificamente às p42/p44 e p38 , participando do fosfatidilinossitol 3-quinase (PI3K) e da sinalização de ceramida . Outros receptores também estão ligados ao ECS como receptores transitórios da subfamília V membro 1 (TRPV-1), receptores peroxisômicos ativados por proliferadores (PPARs) e receptores não-CB1/CB2 com acoplamento de proteínas G GPR55 .
Os ligandos ECS são os canabinóides, incluindo os componentes bioativos da Cannabis Sativa, compostos sintéticos CB-miméticos e ligandos endógenos de receptores CB . A molécula mais importante da primeira categoria é Δ9-THC, bem conhecida pelas suas características psicoactivas . As outras duas categorias incluem ligantes sintéticos que foram desenvolvidos atualmente (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiol, ácido ajulemico, WIN55,212-2) e endocanabinóides que são produzidos pelo corpo humano e são derivados lipídicos mensageiros do ácido araquidônico (AA) conjugados com etanolamina ou glicerol . As mais importantes dessas moléculas são a anandamida (AEA) e o 2-arachidonoylglycerol (2-AG), mas também foram identificadas substâncias adicionais, como a O-arachidonoylethanolamina (OAE, virodhamina), o 2-arachidonoylglycerol éter (2-AGE, éter noladin), a N-arachidonoyldopamina (NADA) e a palmitoylethanolamida (PEA) . Além dos receptores CB e todos os seus ligandos, o ECS também inclui as enzimas essenciais para a biossíntese dos ligantes, transporte e degradação .
Além das funções do ECS para manter a homeostase, a conversa cruzada acima mencionada entre o ECS e as vias oncogênicas mais importantes (MAPK/ERK e PI3K/Percurso do ácido) ganhou recentemente interesse e destacou o significado do ECS na tumorigenese . Além disso, foi demonstrado que os canabinóides induzem apoptose nas células cancerosas, inibem a vascularização tumoral via VEGF e suprimem a capacidade invasiva das células cancerosas. Os efeitos antiproliferativos prevalecem e vários estudos sugerem que os canabinóides têm potencial como agentes antitumorais .
O diagnóstico das lesões da tiróide tem sido aumentado recentemente, não só devido à melhoria das técnicas de diagnóstico, mas também devido ao seu verdadeiro aumento da incidência na população . Na verdade, o carcinoma da tiróide é a malignidade mais comum do sistema endócrino . Embora o câncer de tiróide seja geralmente completamente curado por cirurgia e terapia, 10-20% dos pacientes ainda morrem de recidiva ou progressão tumoral. Portanto, é essencial estabelecer novas estratégias de tratamento e encontrar novos marcadores prognósticos, a fim de prever o curso clínico de cada paciente e personalizar em conformidade as modalidades terapêuticas disponíveis. Neste aspecto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão imunohistoquímica do receptor CB1 e CB2 em lesões benignas e malignas da tireóide em associação com características clinicopatológicas relacionadas ao prognóstico.
2. Pacientes e Métodos
2,1. Pacientes
O material examinado consistiu de 87 peças cirúrgicas histológicas de tireóide de igual número de pacientes submetidos a cirurgia de tireóide para lesões benignas e malignas. Quarenta e três casos benignos (37 nódulos hiperplásicos e 6 Hashimoto tiroidite) e quarenta e quatro casos malignos (40 carcinomas papilares e 4 foliculares) foram incluídos no estudo. Cada neoplasia foi classificada de acordo com a classificação histológica dos tumores da tireóide da OMS. O risco de recidiva foi estimado de acordo com o sistema de estadiamento da American Thyroid Association (ATA) . Nenhum dos pacientes tinha recebido qualquer tipo de tratamento anticâncer antes da cirurgia e não havia histórico clínico de irradiação de cabeça e pescoço ou de outro câncer.
2,2. Imuno-histoquímica
Immunostainings para CB1 e CB2 foram realizados em cortes de tecido tireóide fixados em formol e incluídos em parafina, usando um anticorpo IgG policlonal de cabra CB1 (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotecnologia, Santa Cruz, CA, EUA) e um anticorpo IgG policlonal de coelho CB2 (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotecnologia). Em resumo, 4 seções de tecido espesso μm foram desparafinados em xileno e levados à água através de álcoois graduados. A recuperação do antígeno foi realizada por lâminas de microwaving em tampão citrato 10 mM (pH 6,1) durante 15 minutos (min) a alta potência, de acordo com as instruções do fabricante. Para remover a atividade endógena da peroxidase, as seções foram então tratadas com peróxido de hidrogênio 0,3% em metanol no escuro, durante 30 min, à temperatura ambiente. A ligação não específica de anticorpos foi bloqueada usando Eraser e Sniper, reagentes de bloqueio específicos para anticorpos primários de caprinos e coelhos, respectivamente (Biocare Medical, Concord, Califórnia, EUA), durante 5 min. As secções foram incubadas durante 1 hora (h), à temperatura ambiente, com os anticorpos primários contra CB1 e CB2 diluídos 1 : 300 e 1 : 200, respectivamente, em solução salina tampão fosfato (PBS), de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram então incubadas à temperatura ambiente com reagente de ligação biotinilado (Biocare Medical) durante 10 min, seguido de incubação com rótulo de estreptavidina conjugada com peroxidase (Biocare Medical) durante 10 min. A atividade imune peroxidase resultante foi desenvolvida usando um kit de substrato DAB (Vector Laboratories, Califórnia, EUA) por 10 min. As seções foram contra-manchadas com a hematoxilina de Harris e montadas em Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha). Controles negativos adequados foram realizados omitindo o anticorpo primário e/ou substituindo-o por um anti-soro irrelevante. Como controle positivo, foram utilizados cortes de tecido carcinoma espinocelular de mama e língua móvel com expressão conhecida de CB1 e CB2. A capacidade proliferativa das células foliculares foi avaliada pela expressão imunohistoquímica Ki-67, como descrito anteriormente .
2,3. Avaliação da imunohistoquímica
Avaliação imunohistoquímica foi realizada pela contagem de pelo menos 1000 células tumorais em cada caso por dois observadores independentes (Stamatios Theocharis e Paraskevi Alexandrou) cegos aos dados clínicos, com completa concordância do observador. Os espécimes foram considerados “positivos” para CB1 e CB2 quando mais de 5% das células tumorais dentro da secção foram coradas positivamente. A imunoreatividade das células tumorais para CB1 e CB2 foi pontuada de acordo com a porcentagem de células tumorais CB1 e CB2 positivas como 0: coloração negativa – 0-4% de células tumorais positivas; 1: 5-24% de células tumorais positivas; 2: 25-49% de células tumorais positivas; 3: 50-100% de células tumorais positivas e sua intensidade como 0: coloração negativa, 1: coloração leve; 2: coloração intermediária; 3: coloração intensa . Finalmente, a expressão de CB1 e CB2 foi classificada como baixa, se o escore total fosse 0 ou 2 e alta e se o escore total fosse ≥3 . A imunoreatividade Ki-67 foi classificada de acordo com o percentual de células foliculares positivamente coradas excedeu o valor percentual mediano em duas categorias (abaixo e acima da média), como anteriormente relatado .
2,4. Análise estatística
Testes qui-quadrados foram utilizados para avaliar a diferença de expressão de CB1 e CB2 entre lesões malignas e benignas da tireóide, assim como entre casos de carcinoma papilar e nódulos hiperplásicos. Os testes qui-quadrados foram aplicados para avaliar as associações entre a expressão de CB1 e CB2 e as características clinicopatológicas no subgrupo de pacientes com lesões malignas da tireóide. O qui-quadrado foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS for Windows (versão 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
3. Resultados
3.1. Significância clínica da expressão de CB1 em lesões malignas e benignas da tireóide humana
CB1 positividade (escore IHC > 0) foi observada em 52 (60%) de 87 lesões da tireóide. Trinta e um (36%) dos 87 casos examinados apresentaram alta imunoreatividade CB1 (escore IHC ≥ 3). O padrão subcelular da distribuição do CB1 era predominantemente citoplasmático e ocasionalmente membranoso. As áreas circunvizinhas normais adjacentes ao tumor foram consideradas negativas para o CB1. As Imunoglobulinas representativas CB1 para nódulo hiperplásico e carcinoma papilar estão representadas nas Figuras 1(a) e 1(b), respectivamente. A imunoreatividade do CB1 foi significativamente diferente entre lesões benignas e malignas da tireóide (Tabela 1, ). A alta expressão de CB1 foi significativamente mais freqüente no carcinoma papilífero do que nos nódulos hiperplásicos (Tabela 1, ). A expressão de CB1 não foi associada à idade e sexo dos pacientes e à capacidade proliferativa das células foliculares. No subgrupo de lesões malignas da tireóide, a expressão elevada de CB1 foi observada em 23 (52%) dos 44 casos. Não houve associação entre a expressão do receptor CB1 e o tamanho do tumor, presença de invasão capsular, vascular ou linfática, metástase linfonodal e taxa de proliferação de células foliculares (Tabela 2). A expressão do receptor CB1 não foi associada ao risco de recorrência estimado de acordo com o sistema de estadiamento da ATA (dados não mostrados).
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(c)
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3.2. Significância clínica da expressão CB2 em lesões malignas e benignas da tireóide humana
CB2 positividade (escore IHC > 0) foi observada em 61 (71%) das 87 lesões da tireóide. Trinta e dois (37%) dos 87 casos examinados apresentaram alta imunoreatividade CB2 (escore IHC ≥ 3). O padrão subcelular de distribuição era predominantemente citoplasmático e ocasionalmente membranoso. As áreas circunvizinhas normais adjacentes ao tumor foram consideradas negativas para o CB2. Imunopressões representativas do CB2 para nódulos hiperplásicos e carcinoma papilar estão representadas nas Figuras 1(c) e 1(d), respectivamente. A alta expressão de CB2 foi significativamente mais freqüentemente observada em lesões malignas da tireóide em comparação às benignas, bem como no carcinoma papilar em comparação aos nódulos hiperplásicos (Tabela 1, e , resp.). No subgrupo de lesões malignas da tireóide, a expressão elevada de CB2 foi observada em 24 (55%) dos 44 casos. A alta expressão de CB2 foi significativamente associada à presença de metástases linfonodais (Tabela 2, ). A alta expressão de CB2 também foi associada à presença de capsular, invasão linfática e invasão vascular, em um nível não significativo (Tabela 2, , , e , resp.). Não foram observadas associações entre a expressão do CB2 e a idade e sexo dos pacientes, tamanho do tumor e taxa de proliferação das células foliculares (Tabela 2). A expressão elevada do receptor CB2 foi observada com maior freqüência em lesões malignas da tireóide que apresentaram maior risco de recorrência de acordo com o sistema de estadiamento da ATA, a um nível não significativo ().
4. Discussão
No presente estudo, a expressão da proteína CB1 e CB2 foi aumentada em lesões malignas da tireóide em comparação com lesões benignas da tireóide. Também descrevemos pela primeira vez uma associação entre a expressão da proteína CB2 e parâmetros clinicopatológicos cruciais para o manejo e prognóstico dos pacientes. Notadamente, a expressão aumentada da CB2 foi significativamente associada à presença de metástases linfonodais e fronteira com a presença de invasão vascular, enquanto associações indicativas, mas não significativas, com a presença de invasão capsular e linfática e taxa estimada de recidiva também foram observadas. Resultados semelhantes para a superexpressão do receptor CB1 foram obtidos, no que diz respeito às lesões malignas em comparação às lesões benignas da tireóide; no entanto, foi observada associação ou tendência não significativa de correlação entre a expressão do CB1 e os parâmetros clínico-patológicos.
Em conformidade com os presentes achados, os receptores CB foram upregulados em certos tumores malignos humanos, incluindo carcinoma espinocelular oral, carcinoma pancreático, hepatocelular e carcinoma prostático, enquanto não foram expressos nos tecidos normais desses órgãos. Por outro lado, o receptor CB1 foi desregulado no carcinoma colorretal em contraste com os tecidos normais adjacentes, apontando para os diferentes papéis do ECS em vários tumores e indicando as múltiplas interações entre o ECS e os mecanismos que controlam o crescimento e proliferação celular. Estes mecanismos podem incluir indução direta de morte celular transformada, parada do ciclo celular e inibição da angiogênese e metástase tumoral. Os efeitos antitumorais da ECS também têm sido descritos em numerosos estudos. No câncer colorretal, endocanabinóides e canabinóides sintéticos foram capazes de induzir apoptose e inibir a carcinogênese por mecanismos envolvendo tanto os receptores CB, os canais TRPV1 e a via PPARγ . Resultados semelhantes ocorreram em estudos realizados sobre câncer de pâncreas, pulmão e mama, colangiocarcinoma e carcinoma hepatocelular . Efeitos sinergéticos de canabinóides com quimioterapia convencional antitumoral também foram relatados .
CB receptor overexpression no carcinoma da tiróide foi relatado recentemente, in vitro . Mais precisamente, a estimulação IL-12 das linhas celulares do carcinoma anaplásico da tiróide induziu a superexpressão do receptor CB2 e levou à apoptose mediada por CB2-agonista e à regressão tumoral . Além disso, a upregulação do CB2 tornou as células tumorais mais suscetíveis ao tratamento com quimioterapia padrão . Uma explicação putativa para este fenômeno foi a ativação da via intrínseca mitocondrial dependente de ceramida, que leva à apoptose, sendo desencadeada pela ativação do receptor CB2 . Outro estudo sobre as linhas celulares do carcinoma da tireóide mostrou que a 2-metil-2′-F-anandamida (Met-F-AEA) inibiu o crescimento do tumor, associado a altos níveis de receptores CB1 . A abundante expressão dos receptores de CB1 foi observada em linhas celulares mais sensíveis ao tratamento, que posteriormente foram mais suscetíveis à inibição do crescimento. Tais resultados foram atribuídos à ativação do p53, aumento e diminuição da ciclina A, levando à apoptose .
Parte das possíveis implicações terapêuticas relativas à tumorigenese e ECS, a detecção da superexpressão dos receptores CB pode ter potencial como indicadores prognósticos. A upregulação de ambos os receptores CB em amostras de tecido de carcinoma hepatocelular foi significativamente associada a um melhor prognóstico e maior sobrevida livre de doenças. Tais achados foram combinados com as características histopatológicas do tumor, pois foram observados níveis elevados de receptores de CB em casos que apresentavam boa diferenciação e envolvimento limitado do trato portal. Por outro lado, a imunoreatividade do CB2 foi associada a menor sobrevida livre de doença no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço . Em relação ao receptor CB1, sua superexpressão foi associada ao mau resultado dos pacientes em carcinoma colorretal, prostático e pancreático . Notavelmente, o aumento da expressão do CB1 em pacientes com carcinoma colorretal estágio IV foi independentemente correlacionado com o mau prognóstico . O aumento da expressão do CB1 também foi associado ao adenocarcinoma prostático agressivo, apresentando maior escore de Gleason, maior tamanho do tumor e maior taxa de proliferação celular, bem como metástase no diagnóstico . Além disso, baixa expressão de CB1 ou altos níveis de FAAH/MAGL foram correlacionados com maior taxa de sobrevida e maior estado doloroso. Resultados semelhantes mas não estatisticamente significativos para o receptor CB2 foram observados . Levando-se em consideração os dados acima mencionados, os estudos atualmente disponíveis sobre níveis de receptores de CB e suas associações com prognóstico em vários tumores parecem contraditórios e podem estar intimamente relacionados ao grau de participação da ECS na tumorigenese.
5. Conclusão
Níveis de expressão imunohistoquímica dos receptores CB1 e CB2 melhorados foram correlacionados com a malignidade da glândula tireóide. Além disso, os níveis de expressão melhorada de CB2 foram associados a características clinicopatológicas importantes para o manejo terapêutico dos pacientes. Esses resultados suportaram evidências de que os receptores CB e, especialmente, o receptor CB2 podem interferir nas vias moleculares que participam da transformação maligna da tireóide e podem ser considerados como potenciais alvos terapêuticos para suprimir a progressão tumoral. Estudos de coorte maiores são fortemente recomendados para confirmar e estabelecer a utilidade clínica dos receptores CB como potenciais marcadores prognósticos na neoplasia tireoidiana.
Conflito de Interesses
Todos os autores verificam que não aceitaram nenhum financiamento ou apoio de uma organização que possa de alguma forma ganhar ou perder financeiramente com os resultados do presente estudo. Todos os autores verificam que não foram empregados por uma organização que possa, de alguma forma, ganhar ou perder financeiramente com os resultados do presente estudo. Nenhum dos autores tem qualquer outro conflito de interesses.
Contribuição dos autores
Eleftheria Lakiotaki e Constantinos Giaginis contribuíram igualmente para o estudo.
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