Identificação e caracterização de uma nova neurotoxina botulínica

Bases de dados genômicos revelaram um novo gene BoNT

Na tentativa de pesquisar o panorama evolutivo dos BoNTs, realizamos pesquisas iterativas do modelo Hidden Markov da base de dados de sequências Uniprot. Nossa pesquisa identificou todos os subtipos conhecidos de BoNT e toxinas do mosaico, bem como a neurotoxina do tétano relacionada (Fig. 1a; Suplemento Fig. 1). Para nossa surpresa, a busca revelou um BoNT potencialmente novo, provisoriamente designado BoNT/X (Fig. 1a, GenBank no.: BAQ12790.1), da sequência genômica recentemente relatada da cepa 111 de C. botulinum. BoNT/X mostrou a menor identidade de sequência proteica com as outras BoNTs em comparações de pares (Fig. 1b). Além disso, a baixa semelhança de sequência é distribuída uniformemente ao longo de toda a sequência BoNT/X (Fig. 1c), indicando que não se trata de uma toxina em mosaico. Apesar desta baixa identidade de sequência, a disposição geral de domínio de BoNTs é conservada em BoNT/X (Fig. 1c), incluindo um motivo protease dependente de zinco HEXXH (resíduos 227-231, HELVH) no LC (ref. 33), e um motivo SXWY no HC (resíduos 1.274-1.277, SAWY), que reconhece os gangliosides receptores lipídicos34.

(a) Uma rede filogenética dividida cobrindo todos os serotipos BoNT, subtipos, toxinas de mosaico e neurotoxinas relacionadas ao tétano (TeNT) ilustra suas potenciais relações evolutivas, bem como os conflitos decorrentes de, por exemplo, quimienismos, com base em suas seqüências protéicas. BoNT/X é destacado em vermelho. Uma versão ampliada deste painel é mostrada na Fig. 1 suplementar, com o número de acesso à sequência para cada gene toxínico anotado. (b) Uma árvore filogénica do alinhamento de sequências proteicas para BoNT/A-G, TeNT e BoNT/X, analisada pelo método ClustalW. As percentagens de identificação da sequência entre cada toxina e BoNT/X são anotadas. (c) Painel superior: um desenho esquemático dos três domínios de BoNT/X, com o motivo protease conservado no LC e o motivo ganglioside de ligação no HC anotado. Painel inferior: a análise utilizando uma janela de comparação de sequência deslizante demonstrou que a baixa semelhança entre BoNT/X e outras BoNT/TeNT está uniformemente distribuída ao longo de toda a sequência BoNT/X. O eixo X representa a posição da seqüência de consulta no centro de uma janela de comparação de sequências móveis de 100-amino-ácidos. O eixo Y mostra a percentagem de identidade entre essa janela de sequência e cada uma das sequências de fundo alinhadas. As duas barras na parte superior do gráfico ilustram a melhor correspondência (barra inferior) e se a melhor correspondência está significativamente separada da segunda melhor correspondência (barra superior). (d) Um desenho esquemático do cluster do gene orf que hospeda o gene BoNT/X (painel superior), que tem duas características distintas em comparação com outros clusters conhecidos do orfX (painéis médio e inferior): (1) há uma proteína orfX2 adicional (designada orfX2b) localizada ao lado do gene BoNT/X; (2) o quadro de leitura dos genes orfX tem a mesma direção que o gene BoNT/X.

Semelhante aos outros BoNTs, o gene BoNT/X está localizado em um cluster de genes23. Todas as sete BoNTs estabelecidas são co-expressas com outra proteína de 150 kDa conhecida como NTNHA (non-toxic non-magglutinininin protein), que forma um complexo pH-dependente com BoNTs e as protege das proteases do trato gastrointestinal35. O gene BoNT/X também é precedido por um potencial gene NTNHA (Fig. 1d). Além de BoNT e NTNHA, um cluster típico de genes BoNT contém genes que codificam um dos dois tipos de proteínas acessórias: (1) o cluster HA que codifica três proteínas conservadas HA17, HA33 e HA70, que formam um complexo com BoNT/NTNHA e facilitam a absorção de toxinas através da barreira epitelial intestinal36,37,38; ou (2) o cluster OrfX que codifica as proteínas OrfX1, OrfX2, OrfX3 e P47 conservadas com função desconhecida23. O gene BoNT/X está localizado em um cluster de genes OrfX, assim como BoNT/E, F e membros de BoNT/A. Curiosamente, o cluster BoNT/X tem duas características únicas (Fig. 1d): (1) há um gene OrfX2 adicional que não existe em nenhum outro cluster BoNT (nós o designamos como OrfX2b); (2) o quadro de leitura dos genes OrfX é geralmente oposto aos genes BoNT/NTNHA, mas tem a mesma direção que o gene BoNT/X no cluster BoNT/X (Fig. 1d). Estes achados sugerem que BoNT/X é um ramo único da família BoNT.

A LC de BoNT/X clivagem VAMP2 em um novo site

Para caracterizar BoNT/X, nós focamos primeiro em sua LC (X-LC, resíduos 1-439) e a produzimos como uma proteína His6-tagged em Escherichia coli. As LCs de BoNT/A (A-LC) e BoNT/B (B-LC) foram produzidas e ensaiadas em paralelo como controles. A incubação do X-LC com extratos de detergente cerebral de rato (BDE) não afetou a sintaxe 1 ou SNAP-25, mas aboliu os sinais de immunoblot VAMP2 (Fig. 2a). LCs de BoNTs são proteases dependentes de zinco33. Como esperado, EDTA preveniu a clivagem das proteínas SNARE por X-, A- e B-LCs (Fig. 2a). Além disso, a incubação do X-LC com o domínio citosólico recombinante purificado do VAMP2 (resíduos 1-93) converteu o VAMP2 em duas bandas de baixo peso molecular (Fig. 2a). 2b), confirmando que o X-LC clivou VAMP2.

(a) X-LC foi incubado com BDE. A análise Immunoblot foi realizada para detectar sintaxina 1, SNAP-25 e VAMP2. A sinaptofisina (Syp) serviu como controle de carga. A-LC e B-LC foram analisadas em paralelo. A clivagem do VAMP2 por B-LC resulta em perda de sinais de immunoblot, enquanto a clivagem do SNAP-25 por A-LC gera um fragmento menor (marcado com um asterisco). EDTA bloqueou a atividade de X-, A- e B-LCs. (b) VAMP2 (1-93) foi incubado com X-LC. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e Coomassie Blue staining. X-LC converteu o VAMP2 (1-93) em dois fragmentos menores. (c-e) O VAMP2 (1-93) foi incubado com X-LC. As amostras foram analisadas por espectrometria de massa (LC-MS/MS) para determinar o peso molecular dos fragmentos clivados. Os picos do peptídeo eluído da coluna HPLC são traçados ao longo do tempo de funcionamento (RT, eixo X). Os dados da espectrometria de massa para os dois produtos de clivagem são codificados por cores, com a relação massa/carga (m/z) anotada. O peso molecular é deduzido multiplicando m por z, seguido pela subtração de z. As sequências de proteínas para os dois produtos de clivagem são codificadas por cores e listadas em c. (f) Alinhamento de sequências entre os membros da família VAMP, com os locais de clivagem para BoNT/B, D, F, G e X marcados em vermelho, e os dois motivos SNARE na tonalidade azul. (g) Os VAMP1, 3, 7 e 8 marcados com HA e os Sec22b e Ykt6 marcados com Myc foram expressos em 293T células através de transfecção transitória. Os lisados celulares foram incubados com X-LC e submetidos a análise de immunoblot. Actin é um controle de carga. (h) O Ykt6 marcado com GST foi incubado com X-LC (100 nM). As amostras foram analisadas pela coloração SDS-PAGE e Coomassie Blue. (i) VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) e VAMP5 (1-70) foram incubados com X-LC (100 nM). As amostras foram analisadas pela coloração SDS-PAGE e Coomassie Blue. O X-LC clivou tanto VAMP4 como VAMP5. Notamos que a proteína VAMP5 contém uma banda contaminante que corre perto do produto de clivagem. (j) As experiências foram realizadas como descrito em a, exceto que o VAMP4 e Sec22b foram detectados. O Synaptotagmin I (Syt I) é um controle de carga. O VAMP4 nativo clivado X-LC em BDE. Um de dois (b,g,j) ou três (a,h,i) experimentos independentes é mostrado.

Para identificar o local de clivagem, analisamos a proteína VAMP2 (1-93), com ou sem pré-incubação com X-LC, por espectrometria de massa por cromatografia líquida-tandem (LC-MS/MS, Fig. 2c-e). Um único pico de peptídeo dominante surgiu após a incubação com X-LC (Fig. 2c,e; Suplemento Fig. 2). Seu peso molecular é de 3.081,7, que se encaixa apenas na seqüência de peptídeos A67-L93 do VAMP2 (Fig. 2c,e). Consistentemente, outro fragmento desde o início da his6-tag até o resíduo R66 do VAMP2 também foi detectado (Fig. 2d). Para confirmar este achado, repetimos o ensaio com um fragmento diferente de VAMP2: glutationa S-transferase (GST) marcou VAMP2 (33-86) (Suplemento Fig. 3). A incubação com X-LC gerou um único pico peptídico dominante com um peso molecular de 2.063,1, que cabe apenas A67-R86 de VAMP2 (Suplemento Fig. 3). Juntos, estes resultados demonstram que X-LC tem um único sítio de clivagem no VAMP2 entre R66 e A67.

R66-A67 é um novo sítio de clivagem no VAMP2, distinto de todos os sítios alvo estabelecidos de BoNTs (Fig. 2f). É também o único local de clivagem BoNT localizado dentro de uma região previamente conhecida como motivo SNARE (Fig. 2f, regiões sombreadas)39. A família de proteínas VAMP inclui VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 e 8, bem como as Sec22b e Ykt6 relacionadas. O R66-A67 é conservado no VAMP1 e 3, que são altamente homólogos ao VAMP2. Para validar a especificidade do X-LC, expressamos VAMP1, 3, 7, 8 e Myc-tagged Sec22b e Ykt6 em células HEK293 via transfecção transitória. Os lisados celulares foram incubados com X-LC. Ambos VAMP1 e 3 foram clivados por X-LC, enquanto VAMP7, VAMP8 e Sec22b foram resistentes a X-LC (Fig. 2g).

BoNT/X clivam VAMP4, VAMP5 e Ykt6

Unexpectedly, Ykt6 was also cleaved by X-LC (Fig. 2g). Este achado foi confirmado usando um fragmento Ykt6 marcado com GST purificado, que se deslocou para uma faixa de baixo peso molecular após incubação com X-LC (Fig. 2h). O local de clivagem foi determinado como K173-S174 pela análise de espectrometria de massa do Ykt6 intacto versus Ykt6 clivado por X-LC (Fig. 4 Suplementar). Este local é homólogo ao local de clivagem de BoNT/X no VAMP2 (Fig. 2f). Entre as proteínas da família VAMP, o VAMP4 contém o mesmo par de resíduos (K87-S88) neste local que o Ykt6. Descobrimos que o X-LC clivou tanto o domínio citoplasmático purificado do VAMP4 (Fig. 2i), como o VAMP4 nativo no BDE (Fig. 2j). Como controle, o Sec22b não foi clivado pelo X-LC no BDE. Além disso, o domínio citoplasmático do VAMP5, marcado com GST, também foi clivado (Fig. 2i). Os sítios de clivagem foram determinados pela análise de espectrometria de massa K87-S88 no VAMP4 e R40-S41 no VAMP5 (Fig. 5 Suplementar). Ambos os locais são homólogos ao local de clivagem da BoNT/X no VAMP2 (Fig. 2f), demonstrando que a localização do local de clivagem é conservada através de diferentes VAMPs. A capacidade do X-LC de clivagem do VAMP4, VAMP5 e Ykt6 é altamente incomum, pois suas seqüências são substancialmente diferentes do VAMP1/2/3. BoNT/X é o primeiro e único BoNT conhecido que pode clivar VAMPs além dos alvos canônicos VAMP1, 2 e 3 (ref. 40).

Ativação proteolítica de BoNT/X

A seguir examinamos a região de ligação entre o LC e o HC, que deve ser clivada por proteases bacterianas ou proteases hospedeiras para converter a toxina em uma forma de cadeia dupla ‘ativa’. Produzimos um fragmento recombinante de X-LC-HN (resíduos 1-891) em E. coli e o submetemos a uma proteólise limitada por endoproteinase Lys-C. As amostras foram analisadas através da rotulagem Tandem Mass Tag (TMT) e espectrometria de massa em tandem. TMT rotula N-termini livre (e lisinas). A proteólise limitada por Lys-C produziu um novo terminal N livre mapeado ao resíduo N439 na região linker (Fig. 3a; Dados Suplementares 1), confirmando que a região linker é suscetível a proteases.

(a) Alinhamento sequencial do ligador entre a LC e HC das sete BoNTs estabelecidas mais BoNT/X. O local de corte Lys-C foi identificado pela análise de espectrometria de massa (ver Método e Dados Suplementares 1). (b) Neurônios corticais de ratos cultivados foram expostos ao X-LC-HN durante 12 h. Os lisados celulares foram colhidos e a análise de immunoblot foi realizada para examinar a sintaxe 1, SNAP-25 e VAMP2. Actin é um controle de carga. A-LC-HN e B-LC-HN ativados por tripsina foram analisados em paralelo. O X-LC-HN entrou nos neurônios e o VAMP2 clivado. O X-LC-HN ativado pela Lys-C mostrou uma potência maior do que o X-LC-HN não ativado. O X-LC-HN era mais potente que o B-LC-HN e A-LC-HN, nenhum dos quais clivou seus substratos. (c) WT e mutante X-LC-HN foram ativados por Lys-C e analisados por SDS-PAGE e Coomassie Blue, com ou sem TDT. Os mutantes C461S e C467S mostraram como uma única banda em ∼100 kDa sem TDT, e separados em duas bandas ∼50 kDa com TDT. Uma porção de WT X-LC-HN formou agregados, marcados por um asterisco, que desapareceram com a TDT. A maioria dos WT X-LC-HN ativados separou-se em duas bandas ∼50 kDa sem TDT. Isto é devido ao embaralhamento da ligação de dissulfeto, conforme descrito no painel a seguir. d) O WT X-LC-HN ativado por Lys-C foi incubado com NEM para bloquear o embaralhamento da ligação de dissulfeto. As amostras foram então analisadas pela coloração SDS-PAGE e Coomassie Blue. A maioria das WT X-LC-HN existe como uma banda única em ∼100 kDa sem TDT após tratamento com NEM, indicando que WT X-LC-HN nativo contém uma ligação de bissulfeto entre cadeias. (e) Desenhos esquemáticos da ligação de bissulfeto no WT e três mutantes de cisteína da BoNT/X. (f) Experimentos foram realizados conforme descrito em b, exceto que os neurônios foram expostos aos mutantes WT ou X-LC-HN. A mutação C423S aboliu a atividade do X-LC-HN, enquanto que a mutação C461 ou C467 não afetou a atividade do X-LC-HN. Esses resultados confirmaram que a ligação de dissulfeto entre cadeias é essencial para a atividade do X-LC-HN, e essa ligação de dissulfeto entre cadeias pode ser formada via C423-C461 ou C423-C467. Um de dois (b) ou três (b,c,f) experimentos independentes é mostrado.

Examinamos então se a ativação proteolítica aumenta a potência de BoNT/X. Foi mostrado que a incubação de altas concentrações de LC-HN de BoNT com neurônios cultivados resulta na entrada de LC-HN, provavelmente através da absorção não específica em neurônios41. Similarmente, o X-LC-HN entrou em neurônios corticais de rato cultivados e VAMP2 clivado de forma dependente da concentração (Fig. 3b). A ativação por Lys-C aumentou a potência do X-LC-HN: 10 nM ativado X-LC-HN clivado níveis semelhantes de VAMP2 como 150 nM intacto X-LC-HN (Fig. 3b). O X-LC-HN ativado parece ser mais potente que o LC-HN ativado de BoNT/A (A-LC-HN) e BoNT/B (B-LC-HN), que não mostraram nenhuma clivagem detectável de seus substratos sob as mesmas condições de ensaio (Fig. 3b).

A ligação de dissulfeto entre cadeias em BoNT/X

Como outras BoNT, a região de ligação de BoNT/X contém duas cisteínas conservadas, mas há também uma cisteína adicional (C461) exclusiva de BoNT/X (Fig. 3a). Para determinar os resíduos de cisteína que formam a ligação essencial entre as cadeias de dissulfeto, geramos três mutantes X-LC-HN, cada um com um dos três resíduos de cisteína mutantes (C423S, C461S e C467S). Estes mutantes, assim como o tipo selvagem (WT) X-LC-HN, foram submetidos a proteólise limitada com Lys-C e depois analisados através da coloração SDS-PAGE e Coomassie Blue, com ou sem o agente redutor dithiothreitol (DTT; Fig. 3c). Espera-se que a única cisteína na LC (C423S), em mutação, elimine a ligação de dissulfeto entre as cadeias. De forma consistente, o C423S mutante separou-se em duas bandas ∼50 kDa sem TDT. Em contraste, ambos os mutantes C461S e C467S apresentaram como uma única banda a 100 kDa na ausência da TDT e separados em duas bandas ∼50 kDa na presença da TDT. Estes resultados sugerem que o C423 no LC pode formar a ligação de dissulfeto entre as cadeias com C461 ou C467 no HC. Também descobrimos que o tratamento com Lys-C degradou uma porção significativa de C423S mutante em comparação com C461S ou C467S mutante (Fig. 3c, +DTT), sugerindo que a perda da ligação dissulfeto inter-cadeia torna a molécula mais suscetível a proteases. Observamos que uma porção de WT X-LC-HN formou agregados no topo do gel SDS-PAGE (Fig. 3c, marcada por um asterisco). Estes agregados desapareceram na presença da TDT. C423/C461/C467 são as únicas três cisteínas no X-LC-HN; a mutação de qualquer uma delas aboliu a formação de agregados (Fig. 3c, -DTT), sugerindo que estes agregados são formados por ligações de dissulfeto intermoleculares devido à existência de uma cisteína extra na região do linker.

Interessantemente, a maioria dos WT ativados X-LC-HN separados em duas bandas ∼50 kDa sem TDT (Fig. 3c), que é semelhante ao mutante C423S. Por outro lado, o WT X-LC-HN não apresentou aumento da degradação por Lys-C em relação ao C423S mutante (Fig. 3c, +DTT). Uma explicação possível é que o WT X-LC-HN contém uma ligação de dissulfeto entre cadeias sob condições nativas, mas essa ligação pode se rearranjar para o par C461-C467 intra-cadeia sob condições de desnaturação no buffer SDS. Este fenômeno é conhecido como embaralhamento da ligação de bissulfeto, que ocorre frequentemente entre cisteínas adjacentes. Para testar esta hipótese, utilizamos um reagente alquilante, N-Ethylmaleimida (NEM), que bloqueia permanentemente as cisteínas livres e impede o embaralhamento da ligação de dissulfeto. Como mostrado na Fig. 3d, o WT X-LC-HN pré-tratado com NEM mostrou como uma única banda a 100 kDa na ausência da TDT, e separada em duas bandas ∼50 kDa na presença da TDT. Estes resultados confirmam que o WT X-LC-HN contém principalmente uma ligação de dissulfeto inter-cadeia, mas é suscetível ao embaralhamento da ligação de dissulfeto devido a uma cisteína extra na região do linker (Fig. 3e).

Examinamos ainda mais a atividade dos três mutantes de cisteína X-LC-HN em neurônios cultivados. Como esperado, o mutante C423S estava inativo, enquanto os mutantes C461S e C467S apresentaram níveis de atividade similares aos do WT X-LC-HN (Fig. 3f). Esses resultados confirmam que a ligação dissulfeto inter-cadeia é crítica para a atividade de BoNT/X.

Geração de BoNT/X a todo comprimento através de ligadura ordenado-mediada

Procuramos então determinar se BoNT/X a todo comprimento é uma toxina funcional. Como não existem antisoros contra BoNT/X, decidimos evitar a geração do gene da toxina activa a todo o comprimento. Em vez disso, desenvolvemos uma abordagem para gerar uma quantidade limitada de BoNT a todo o comprimento em tubos de ensaio por ligação enzimática de dois fragmentos não tóxicos de BoNT. Este método utiliza uma transpeptidase conhecida como sortase42,43, que reconhece o motivo peptídeo LPXTG, cliva-se entre T-G, e simultaneamente forma uma nova ligação peptídeo com outras proteínas/peptídeos contendo N-terminal glycine (Fig. 4a). Produzimos dois fragmentos não tóxicos de BoNT/X: (1) LC-HN com um motivo LPETGG e uma His6-tag fundida ao terminal C; e (2) o HC de BoNT/X (X-HC) com uma etiqueta GST, local de clivagem da trombina e um resíduo adicional de glicina no seu terminal N. O corte por trombina libera X-HC com uma glicina livre em seu terminal N. A incubação destes dois fragmentos com sortase gerou uma pequena quantidade de ∼150 kD BoNT/X (X-FL, Fig. 4a,b). Observamos que o X-HC mostrou baixa solubilidade e forte tendência à agregação, o que pode ser a razão da baixa eficiência de ligadura (Fig. 4b). Em contraste, a ligadura do X-LC-HN com o HC da BoNT/A (A-HC) alcançou uma melhor eficiência, com a maioria do X-LC-HN ligado a uma toxina quimérica XA (Suplemento Fig. 6a). Para garantir a biossegurança, a quantidade de fragmentos precursores na reação é estritamente limitada para gerar a quantidade mínima de toxina ligada necessária para os ensaios funcionais.

(a) Um desenho esquemático do método de ligadura por sortase. (b) As misturas de reacção de ligadura de sortase foram analisadas pela coloração SDS-PAGE e Coomassie Blue. O asterisco marca os agregados de proteínas devido às ligações intermoleculares de dissulfureto. BoNT/X (X-FL) a todo o comprimento apareceu apenas na mistura de ligadura de sortase. (c) Neurônios expostos à mistura de ligação da separase (15 μl) ou misturas de controle por 12 h em meio de cultura. Os lisados celulares foram analisados por immunoblot. A mistura contendo ambos X-LC-HN e X-HC (mas não a separase) clivou ligeiramente mais VAMP2 do que apenas X-LC-HN. A ligação do X-LC-HN e X-HC por meio da separadora melhorou ainda mais a clivagem do VAMP2, demonstrando que o X-FL ligado é funcional em neurônios. (d) BoNT/A-G, BoNT/DC e BoNT/X foram submetidos ao ensaio de ponto blot, usando quatro anti-BoNT/A, B e E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC e anti-BoNT/F), bem como dois antissoros de cabras (anti-BoNT/G e anti-BoNT/D). BoNT/X é composto por X-LC-HN e X-HC na proporção 1:1 molar. Estes antissoros reconheceram as suas toxinas alvo correspondentes, mas nenhum reconheceu BoNT/X. Os antissoros contra BoNT/DC e BoNT/C reagem de forma cruzada, já que estas duas toxinas compartilham um alto grau de similaridade dentro de seus domínios HC. (e) Neurônios corticais de rato cultivados foram expostos ao X-FL ligado em meio de cultura por 12 h, com ou sem duas combinações de anti-soros. Ab1: anti-BoNT/A/B/E trivalente, anti-BoNT/C e anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G e anti-BoNT/D. O anti-BoNT/A/B/B/E trivalente foi usado com diluição 1:50. Todos os outros anti-soros foram usados a 1:100 de diluição. Nenhum dos anti-soros afetou a clivagem do VAMP2 e VAMP4 por X-FL. A especificidade e a potência destes anti-soros foram validadas pela sua capacidade de neutralizar os serótipos alvo no mesmo ensaio como descrito na Fig. 7. (f) O X-FL ligado por reação de sortase (0,5 μg) foi injetado nos músculos gastrocnêmicos do membro posterior direito de ratos (n=4). O membro injetado desenvolveu paralisia flácida típica, e os dedos dos pés não se espalharam dentro de 12 h. O membro esquerdo não foi injetado com toxinas, servindo como controle. (g) A forma totalmente inativa de BoNT/X (BoNT/XRY) foi purificada como uma proteína recombinante his6-tagged em E. coli. BoNT/XRY purificada é mostrada na Fig. 8b suplementar. Uma de duas (e) ou três (c,d) experiências independentes é mostrada.

Analisamos primeiro a atividade de BoNT/X ligado usando neurônios corticais de rato cultivados. Os neurônios foram expostos à mistura de ligação de sortase e misturas de controle em meio de cultura. Como mostrado na Fig. 4c, somente o X-LC-HN clivou algum VAMP2 devido a sua alta concentração na mistura de reação. Misturando X-HC com X-LC-HN sem clivagem de separação ligeiramente melhorada do VAMP2 em relação ao X-LC-HN sozinho, sugerindo que o X-HC pode estar associado ao X-LC-HN através de interações não covalentes. Essa interação parece ser específica, pois misturar A-HC com X-LC-HN não melhorou a clivagem do VAMP2 em neurônios (Suplemento Fig. 6b). A ligação do X-LC-HN com o X-HC por meio de clivagem claramente melhorada do VAMP2 em comparação com a mistura de X-LC-HN e X-HC sem a clivagem (Fig. 4c). Estes resultados demonstraram que o X-HC é funcional para células-alvo e que o BoNT/X ligado a todo o comprimento entrou nos neurônios e clivou o VAMP2. Similarmente, o XA ligado também entrou nos neurônios e o VAMP2 clivado (Suplemento Fig. 6b).

BoNT/X não foi reconhecido por anti-soros contra BoNTs conhecidas

Realizamos em seguida ensaios de ponto blot usando anti-soros levantados contra BoNTs conhecidas, incluindo todos os sete serótipos, bem como uma toxina em mosaico (BoNT/DC), para confirmar que BoNT/X é serologicamente único. Foram utilizados quatro antissoros de cavalo (anti-BoNT/A, B e E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC e anti-BoNT/F), bem como dois antissoros de cabra (anti-BoNT/G e anti-BoNT/D). A especificidade e potência destes antissoros foram primeiramente validadas através da análise da sua capacidade de neutralizar a BoNT em neurónios cultivados. Como esperado, todos os antissoros neutralizaram os seus anti-BoNTs alvo, sem afectar a actividade de um serótipo diferente (Fig. 7 Suplementar). Descobrimos que estes antissoros reconheceram suas BoNTs correspondentes no ensaio dot blot, mas nenhum reconheceu BoNT/X (Fig. 4d).

Analisamos ainda se a toxicidade da BoNT/X em neurônios pode ser neutralizada por estes antissoros. O X-FL gerado pela ligadura por meios de ordenação foi primeiramente ativado com proteólise limitada usando tripsina. Utilizámos a tripsina para activar a X-FL em vez da Lys-C para ensaios funcionais, uma vez que a tripsina nos permite parar a proteólise utilizando inibidores de tripsina. O X-FL activado entrou nos neurónios corticais de rato de cultura e clivou tanto o VAMP2 como o VAMP4 de forma dependente da concentração (Fig. 4e). As combinações de antissoros contra BoNTs conhecidos (Ab1 (antissoros de cavalo): anti-BoNT/A, B e E trivalente, anti-BoNT/C e anti-BoNT/F; Ab2 (antissoros de cabra): anti-BoNT/G e anti-BoNT/D) não afetaram a atividade do X-FL ligado, como evidenciado por graus similares de clivagem VAMP2 e VAMP4 na presença desses antissoros (Fig. 4e). Estes resultados confirmaram que BoNT/X é um novo sorotipo de BoNT.

BoNT/X paralisia flácida induzida in vivo em ratos

A seguir procuramos determinar se BoNT/X é ativo in vivo usando um ensaio bem estabelecido e não letal em ratos, conhecido como ensaio DAS (Digit Abduction Score), que mede a paralisia muscular local após a injeção de BoNTs nos músculos dos membros posteriores do rato44. BoNTs causam paralisia flácida dos músculos dos membros, que se manifesta como a incapacidade de espalhar os dedos dos pés em resposta a um estímulo de susto. Injetamos X-FL ligado (0,5 μg, ativado pelo tratamento com tripsina) nos músculos gastrocnêmicos do membro posterior direito em camundongos, o que induziu paralisia flácida típica e a não propagação dos dedos dos pés (Fig. 4f), indicando que BoNT/X é capaz de causar paralisia flácida in vivo. Observamos que a potência do X-FL ligado parece ser muito menor do que a de outros BoNTs neste ensaio. Para confirmar ainda mais a baixa toxicidade do X-FL ligado, injetamos 1 μg de X-FL ligado por via intraperitoneal (n=3). Nenhum rato mostrou qualquer efeito sistémico e todos sobreviveram a esta dose. Assim, o X-FL ligado tem uma toxicidade in vivo bastante baixa em camundongos em comparação com outros BoNT nativos, que geralmente têm doses letais a baixos níveis de picograma por camundongo.

BoNT/X

Finalmente, desenvolvemos um mutante inativo de BoNT/X como um reagente potencial para gerar anticorpos neutralizantes. Mutações em dois resíduos (R362A/Y365F) em BoNT/A inativam a atividade protease do LC e abolem a toxicidade do BoNT/A in vivo45,46. Estes dois resíduos são conservados em BoNT/X. Introduzimos as mutações correspondentes (R360A/Y363F) em BoNT/X e geramos uma forma inativa completa, designada como BoNT/XRY. Como mostrado na Fig. 4g, BoNT/XRY foi purificada como uma proteína his6-tagged em E. coli, e não teve atividade em neurônios cultivados (Suplemento Fig. 8a). Além disso, a injeção intraperitoneal de ratos com 30 μg BoNT/XRY (ativada pelo tratamento com tripsina) não causou nenhum efeito adverso (n=5), demonstrando que não é tóxica in vivo. Uma porção substancial de BoNT/XRY formou agregados na parte superior do gel SDS-PAGE (Fig. 4g). A adição de TDT reduziu estes agregados a BoNT/XRY monoméricos (Fig. 4g). Assim, BoNT/X a todo o comprimento é susceptível de formar ligações de dissulfureto intermoleculares. No entanto, a forma monomérica de BoNT/X pode ser purificada e é estável em solução (Fig. 4g). Além disso, desenvolvemos um protocolo de purificação em escala, que gerou BoNT/XRY com um rendimento de ∼3 mg por litro de cultura e pureza de ∼3% (Suplemento Fig. 8b). BoNT/XRY altamente purificado permaneceu estável em solução até 10 mg ml-1 na presença de agente redutor. Este BoNT/XRY atóxico será um reagente valioso para gerar anticorpos neutralizantes.