Guanidine

Proteínas de membrana

Solventes desnaturalizantes de soluções de guanidina e SDS, mas é claro que também queríamos caracterizar os estados nativos das proteínas de membrana. A dificuldade aqui era que ainda não havia um consenso sobre como definir ou conceber o estado nativo – o que, para recém-chegados como nós, se traduzia em incerteza, pois não tínhamos o tipo de experiência que nos permitisse fazer um adivinhação astuta sobre qual das idéias em disputa se provaria correta.

O bilayer fosfolípido, o conceito indispensável para a mais mínima compreensão das membranas celulares, ainda estava sendo disputado, apesar de ter sido demonstrado pela primeira vez nos glóbulos vermelhos quase 50 anos antes e de ser realmente o único arranjo concebível com base na termodinâmica, uma conseqüência direta das medidas clássicas de Irving Langmuir de 1917 com monocamadas de substâncias anfíclicas. Descrevi no meu livro Ben Franklin Stilled the Waves a aceitação ridiculamente lenta do conceito de bilayer no período de intervenção. O ponto aqui é que o ceticismo ainda persistia quando nos envolvemos na pesquisa de membranas.

E entre aqueles que estavam convencidos sobre o bico lipídico, a forma de incorporação de proteínas nas membranas ainda estava aberta ao debate. Alguns, como o nosso colega Duque David Robertson, estavam relutantes em acreditar que as proteínas poderiam realmente penetrar ou atravessar um bileiro. Duas imagens conceituais bastante díspares, tiradas de uma conferência na Academia de Ciências de Nova York em 1972, são mostradas na Figura 3 . Uma é a “membrana unitária” de Robertson com proteína totalmente do lado de fora. A outra dá a visão de Vanderkooi dos complexos de citocromo oxidase nas membranas mitocondriais: a proteína é posicionada de forma mais realista, mas ainda não há nenhuma concepção de domínios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos e como eles podem ditar a interação proteína-lipídeo. Mais tarde, nesse mesmo ano de 1972, o agora convencional quadro idealizado de bilayers fosfolípidos, com proteínas funcionais passando por eles, finalmente tornou-se popularizado pelo modelo “mosaico fluido” de Singer e Nicolson .

Fig. 3. Duas imagens conceituais distintas de proteínas de membrana, ambas propostas na mesma reunião em Nova York em 1972 : (a) Robertson pensou que as proteínas seriam assimetricamente dispostas, fora das duas superfícies do bico; (b) A visão de Vanderkooi dos complexos de citocromo oxidase em seção transversal.

No laboratório estes eram tempos excitantes, os mais excitantes que eu posso lembrar. Aprendemos a usar detergentes benignos, que, ao contrário da SDS, podiam solubilizar proteínas de membrana sem desnaturação bruta, num ambiente que simulava o estado nativo, mas um ambiente onde também seriam facilmente acessíveis para a caracterização molecular – um avanço no qual fomos em parte antecipados por dois jovens agradáveis da Finlândia, Kai Simons e Ari Helenius .

Na prática ainda estávamos confinados a medir o peso molecular e a perguntar quantas cadeias de polipeptídeos por molécula, mas as proteínas a que estas questões eram dirigidas tinham sido separadas por tratamento detergente de outros componentes da membrana. Mais importante, muitas das proteínas tinham funções celulares conhecidas e as nossas medições eram relevantes para estas funções. Eu já mencionei os glóbulos vermelhos, mas na verdade conseguimos cobrir uma série de tópicos biologicamente relevantes, estimulados em muitos casos pelo zelo missionário dos estudantes. Por exemplo, um estudante de fisiologia, Stuart Grefrath, com interesse em neurofisiologia, veio ao nosso laboratório para enumerar as cadeias de polipéptidos de uma membrana excitável – neste caso do nervo olfactivo do garfish – e isto levou-nos ao envolvimento subsequente com vários outros sistemas de transporte activos. (O próprio Stuart infelizmente morreu como resultado de uma doença cardiovascular congénita antes de poder cumprir a sua promessa inicial com uma carreira independente). A mielina cerebral era outra membrana do sistema nervoso que olhamos para .

Também vale a pena destacar dois visitantes do laboratório que escolheram trabalhar juntos: Neal Robinson, um pós-doutorando, e Leon Visser, que estava de licença sabática do CSIR em Pretória, África do Sul). Eles fizeram um trabalho muito limpo de definir quantitativamente a estrutura de domínio do citocromo b5, uma espécie de protótipo para ilustrar como as proteínas de membrana são fixadas às membranas e ainda desempenham sua função no citoplasma adjacente .

Em outros projetos, estávamos respondendo a pedidos de colegas distantes. Já mencionei o trabalho com Arthur Karlin sobre o receptor de acetilcolina de um peixe elétrico. Outro exemplo foi a bacteriorhodopsina, para a qual fizemos medições em solução detergente a pedido de Walter Stoeckenius, da Universidade da Califórnia. Havia aqui uma questão importante, relacionada com o mecanismo da actividade de bombeamento do protão desta proteína: a proteína nativa é funcionalmente um monómero ou (como alguns dados pareciam sugerir) é um trimer? Nossa proteína solubilizada era inquestionavelmente um monômero e evidências espectrais indicavam que ela estava passando pelo mesmo ciclo de mudanças moleculares que na membrana nativa.

Na maioria dos casos, nós mesmos não nos envolvemos diretamente na tentativa de tentar descobrir como os receptores ou bombas ou canais funcionavam, mas inevitavelmente nos tornamos conscientes de quais eram os problemas. Foi uma experiência verdadeiramente enriquecedora, bastante diferente dos dias em que a albumina sérica e β-lactoglobulina (obtida de fornecedores comerciais) eram os principais alvos de nossa pesquisa.

No caso de bombas de íons, nós realmente entramos na fisiologia, principalmente no nível de hipóteses ou teoria; aprendemos como modelar esquemas cinéticos com um computador; participamos de conferências apropriadas; etc. Nossa licença sabática final – para o Instituto Max Planck em Heidelberg – foi importante a esse respeito. O presidente do departamento de fisiologia da Duke, Ted Johnson, juntou-se a nós nesta ocasião, por isso éramos três em colaboração activa. Ted era um entusiasta de computadores há muito tempo, e tinha ligado cada membro individual do corpo docente de fisiologia à instalação central de computadores do Triângulo de Pesquisa da Carolina do Norte antes de se tornar moda gastar os fundos do departamento dessa forma. Naqueles dias tínhamos que escrever nossos próprios programas para o computador, o que era difícil para mim, mas acredito que obtivemos alguns resultados úteis, principalmente em modelos cinéticos para o ciclo de bombeamento da bomba Na,K acionada por ATP. Trabalhamos horas pouco ortodoxas, incluindo fins de semana e feriados, o que às vezes descontrolava os nossos anfitriões de Heidelberg, que estavam acostumados a desligar o aquecimento central quando o laboratório deveria estar desocupado. A cada dez dias atravessávamos a fronteira em direção a Estrasburgo para um almoço gourmet – acompanhado de vinhos alsacianos, cujo sabor temos apreciado desde então.