Gama-Glutamil Transpeptidase

>

Atividade e Especificidade

>

Por isso a reação catalisada por esta enzima é geralmente entendida como a transferência de um grupo γ-glutamyl para uma variedade de moléculas aceitantes como água, aminoácidos, dipeptídeos e o próprio γ-glutamyl doador, dependendo das condições de reação. Essas propriedades catalíticas estão associadas ao mecanismo catalítico do GGT, no qual a reação procede por um mecanismo de duplo deslocamento acilo-desactilação através de uma enzima intermediária γ-glutamyl.

Como esperado das estruturas do substrato natural glutationa e seus derivados, o GGT reconhece estritamente a moiety γ-glutamyl, mas tem uma especificidade de substrato bastante ampla em relação ao grupo de saída (Xaa). Glutatião, seus conjugados S, dissulfureto de glutatião, γ-glutamil di- ou tripeptídeos, glutamina, derivados l-α-metil de γ-glutamil amidas, leucotrieno C4, derivados poli-γ-glutamil são todos aceitos como substratos. Substratos artificiais como l-γ-glutamil-p-nitroanilida (l-γ-Glu-pNA) e fluorescentes l-γ-glutamil-7-amino-4-metilcumarina (l-γ-Glu-AMC) são substratos ativos comumente utilizados na presença ou ausência de aceitadores de γ-glutamil (ver abaixo) para o ensaio de transpeptidase ou hidrolase, respectivamente.

A especificidade do substrato em relação ao aceitante é estudada mais extensivamente com o GGT de rim de rato. Os isómeros l de aminoácidos neutros tais como l-cystine, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys e l-Ser são bons aceitadores, mas os aminoácidos hidrofóbicos e de cadeia ramificada tais como l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile e l-Val são substratos bastante pobres. d-Aminoácidos e α-substituted aminoácidos não actuam como substratos aceitadores. Portanto, o uso de d-γ-Glu-pNA é uma maneira conveniente para suprimir a autotranspeptidation na medição da atividade da hidrolase. Uma vez que o local de ligação do aceitador se sobrepõe com os subsitos para o grupo Cys-Gly de glu-pNA, a enzima prefere os dipeptídeos com Gly no terminal C como l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly e l-Ser-Gly como substratos aceitadores em ordem decrescente de atividade relativa. Os peptídeos com mais de dois resíduos de aminoácidos são muito pouco aceitáveis. Os valores de Km para os aminoácidos e dipeptídeos aceitantes são relativamente altos, situando-se no intervalo de 0,1 a 5 mM , mas a Glica-Gly (Km=3 mM) é mais convenientemente utilizada como substrato aceitante para a atividade da transpeptidase. Altas concentrações de moléculas aceitantes inibem a GGT competitivamente com respeito ao doador de γ-glutamyl (γ-Glu-Xaa), provavelmente devido à sobreposição do local de ligação para Xaa e do local de ligação para o aceitador. A especificidade do substrato em relação ao subsite Cys depende da origem da enzima; a enzima E. coli, por exemplo, prefere os aminoácidos básicos (l-Arg, l-Lys e l-His) e os aminoácidos aromáticos (l-Phe, l-Trp e l-DOPA) neste site . No entanto, a especificidade do aceitante deve ser tomada com cuidado, pois a atividade aparente também depende da concentração efetiva do aminoácido desprotonado disponível no pH em questão. A actividade relativamente elevada observada com a Glicolina deve-se em parte à baixa pKa deste dipeptídeo . Os grupos de aminoácidos desprotonados dos substratos aceitantes parecem ser necessários para a transpeptidation.

O substrato doador mais utilizado para o ensaio enzimático é l-γ-Glu-pNA. Uma mistura típica para o ensaio da actividade transpeptidase da enzima do rim de rato consiste em 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly em Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) a 25°C. A adição de uma concentração suficiente de Gly-Gly suprime eficazmente a hidrólise e a autotranspeptidation. O pH ideal de GGT é cerca de 7,5-9 para transpeptidation, mas a dependência de pH é muito menor para a hidrólise. Isto é consistente com o fato de que a atividade aparente da transpeptidase é dependente, em parte, da concentração efetiva do grupo amino livre de aceitantes .

A atividade de hidrolase para glutamina é aumentada em até 12 vezes pela adição de moduladores direcionados ao local do aceitante, tais como maleato, hipagrato e glicocholato. A adição destes compostos inibe a ligação dos substratos aceitantes e dos doadores de glutamil γ-glutamil que ocupam os subsitos Cys-Gly. A adição de doadores de γ-glutamil ou a ligação de inibidores no site doador γ-glutamil aumenta a afinidade desses moduladores, indicando interações cooperativas entre os sites de ligação de doadores e aceitadores de γ-glutamil (para uma revisão ver Tate & Meister ). O site de aceitadores ocupado por estes moduladores é sugerido para promover uma mudança conformacional do GGT para uma forma ativa, facilitando assim a formação de um estado de transição. Isto também é proposto para explicar o aumento na taxa de inativação das enzimas mamíferas pela acivicina (vide infra), mas isto não foi observado com a inibição por um γ-monofluorofosfonato, um rótulo de afinidade analógico-estatal de transição direcionado para o site ativo. A acivicina parece ligar-se a um resíduo nucleofílico diferente do nucleófilo catalítico do GGT de mamífero .

GGT é reversivelmente e competitivamente inibido por l- e d-γ-glutamil-(o-carboxi)fenilidrazida (anthglutin, produzido por Penicillium oxalicum) com um Ki de 8 μM, e nenhuma toxicidade aguda é relatada para ratos . Vários análogos de glutamato com um grupo reativo próximo ao grupo γ-carboxi atuam como inibidores irreversíveis. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucina (DON), O-diazoacetyl-l-serina (l-azaserina) e l-(αS,5S)-α-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazoleacético (acivicina ou AT-125, produzido por Streptomyces sviceus) são potentes, mas inativadores inespecíficos de GGT . A acivicina tem sido amplamente utilizada para suprimir a atividade do GGT in vivo , embora a acivicina seja altamente tóxica pela inativação de várias glutaminas amidotransferases envolvidas na biossíntese de nucleotídeos, aminoácidos e aminoácidos. O complexo serina-borato é ligado reversivelmente ao site γ-glutamyl binding site para inibir o GGT com um Ki de 20 μM . Esta descoberta clássica levou a um potente inibidor de ligação lenta, o ácido l-2-amino-3-boronobutanóico (γ-boroGlu) . O GGT é inibido com um Ki total de 17 ou 35 nM, mas a inibição ainda é reversível. O ácido 2-amino-4-(fluorofosfono)butanóico (γ-PFGlu), um glutamato análogo ao fósforo eletrofílico que substitui o γ-carboxi, é um poderoso agente de rotulagem de afinidade direcionada por mecanismo e por local ativo do E. coli GGT . Este composto inibe rápida e irreversivelmente o GGT para formar um adutor estável, aniônico e tetraédrico de transição-estado, que é passível de mapeamento peptídeo para identificar o nucleófilo catalítico do E. coli GGT (vide infra). Uma série de análogos de glutamato de γ-(monofenil)fosfono e γ-fosfonodiésteres servem como inibidores baseados em mecanismos que inibem o GGT irreversivelmente pela modificação covalente de seu nucleófilo catalítico. Em particular, os fosfonodiésteres γ que incorporam a mímica estrutural da Cys-Gly e seu grupo carboxi terminal C exibem atividades extraordinariamente altas em relação ao GGT humano, sendo a taxa de inativação de 130 a 6000 vezes mais rápida que a da acivicina. A inibição é seletiva para GGT, e nenhuma toxicidade é observada. Um desses inibidores está comercialmente disponível sob o nome de ‘GGTop’ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Um inibidor analógico não glutamato de GGT humano é encontrado por meio de triagem de alta produção . Este composto ocupa o site de aceitação do complexo de substrato de γ-glutamil com um Ki de 17,6 μM. O inibidor é seletivo de espécies, mas é reversível, e alguma toxicidade é relatada.

Pensa-se que a reação catalisada pelo GGT proceda com um mecanismo de ping-pong através de um intermediário da enzima γ-glutamil como observado com hidrolases serinas . O N-terminal Thr Oγ na pequena subunidade é o nucleófilo catalítico ao qual está ligado um grupo γ-glutamil (ver Química Estrutural). O nucleófilo catalítico do GGT foi identificado pela primeira vez com E. coli GGT como o resíduo N-terminal Thr (Thr391) na pequena subunidade pelo mapeamento peptídeo da enzima inativada com γ-PFGlu . Este resíduo, correspondente a Thr380 (enzima do rim de rato) e Thr381 (enzima humana), é conservado entre todos os GGTs cujas sequências primárias são conhecidas. O nucleófilo catalítico do GGT humano é identificado como Thr381 pelo mapeamento peptídeo da enzima inativada pelo selo de afinidade γ-(monofenil)fosfono . Portanto, a reação catalisada pelo GGT começa com o ataque nucleófilo do resíduo N-terminal Thr na pequena subunidade na carboxilo γ de um substrato doador (γ-Glu-Xaa) para eliminar o Xaa. A enzima γ-glutamil assim formada reage com água (hidrólise) ou com aminoácidos e dipeptídeos (transpeptidation e autotranspeptidation) na etapa determinante da taxa.

GGT é um membro do N-terminal nucleófilo hidrolases (Ntn-hidrolases) como previsto a partir de sua prega única e do processo de maturação, no qual uma forma dimérica ativa da enzima madura é gerada pelo processamento autocatalítico pós-tradicional do precursor catalítico inativo. Isto é confirmado pela mutagénese dirigida ao local e pela análise estrutural das enzimas bacterianas por raios X (ver Química Estrutural).