Galinato de Cálcio e Contas de Alginato-Calcinato contendo Celecoxib Solubilizado em fase auto-emulsificante
Abstract
Neste trabalho foram desenvolvidas contas de alginato e alginato-chitosano contendo celecoxib solubilizado em fase auto-emulsificante, de modo a obter um sistema de administração de fármacos para administração oral, capaz de retardar a libertação do fármaco em ambiente ácido e de o promover no compartimento intestinal. A lógica deste trabalho esteve ligada ao desejo de melhorar a eficácia terapêutica do celecoxib, reduzindo seus efeitos adversos gástricos e favorecendo seu uso na profilaxia do câncer de cólon e como coadjuvante na terapia da polipose familiar. Os sistemas foram preparados por gelificação ionotrópica utilizando agulhas com diferentes diâmetros (400 e 600 μm). Foram investigados a morfologia, tamanho das partículas, comportamento de inchaço e desempenho de liberação de drogas in vitro dos grânulos em meio aquoso com pH diferente. Os resultados experimentais demonstraram que a presença de quitosano na formulação causou um aumento da resistência mecânica da estrutura do grânulo e, como consequência, uma limitação da capacidade de inchaço do grânulo e uma diminuição da taxa de liberação do fármaco em pH neutro. Algino-chitosano poderia ser uma boa ferramenta para garantir uma entrega de cólon celecoxibe.
1. Introdução
Sistemas de administração de fármacos contendo polímeros naturais biodegradáveis são objecto de cada vez mais estudos de investigação considerando as vantagens que estes materiais podem oferecer . Entre eles, aqueles que contêm alginato e quitosano têm sido amplamente explorados no campo farmacêutico .
Alginato é um biopolímero natural solúvel em água extraído de algas marrons e composto de blocos alternados de 1-4 α-L-gulurônico e β-D- resíduos de ácido manurônico . Este polímero forma hidrogel em presença de cátions divalentes como Ca2+, Ba2+, Sr2+, e Zn2+ e esta característica permite preparar contas carregadas de drogas . O mecanismo deste processo de gelificação envolve resíduos gulurônicos com a quelação específica do Ca2+ formando a chamada estrutura de “caixa de ovos” . Muitos pesquisadores concentraram sua atenção no desenvolvimento de esferas de alginato de cálcio como sistemas de administração controlada de drogas para a administração oral de moléculas e proteínas de drogas .
Chitosan é um polissacarídeo linear biocompatível, biodegradável, não tóxico, composto de unidades de D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina ligadas por β-(1-4) ligações glicosídicas . A quitosana pode ser derivada por deacetilação parcial da quitina a partir de conchas de crustáceos e é amplamente utilizada para cultura celular, administração de medicamentos e aditivos alimentares. No complexo polielectrólito de alginato e quitosano de entrega controlada de medicamentos, tem recebido muita atenção nos últimos anos. Os dois polímeros formam o complexo polieletrólito através da interação iônica entre os resíduos de carboxil do alginato e os resíduos de aminoácidos do quitosano. As esferas de alginato-quitosano podem ser produzidas por diferentes métodos: o procedimento de duas etapas e o procedimento de uma etapa . Na primeira, as esferas de gel de alginato de cálcio são produzidas deixando cair uma solução de alginato num banho gelificante que contém iões de cálcio. Os grânulos resultantes são então transferidos para uma solução de quitosano para formar a membrana na sua superfície. O procedimento de uma etapa exige que as gotículas de solução de alginato caiam numa solução aquosa contendo tanto o agente gelificante para alginato (por exemplo, iões de cálcio) como o quitosano . A escolha do método de produção é responsável pelas propriedades dos grânulos, devido à quantidade de quitosano ligado no produto resultante. Ao mesmo tempo, as características dos grânulos são afectadas pelo peso molecular dos polímeros seleccionados e/ou pelas percentagens dos vários resíduos nas moléculas poliméricas .
Celecoxib, um derivado benzenossulfonamida fluorada, é um anti-inflamatório não esteróide (NSAID) com uma acção inibidora altamente selectiva da ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Possui atividades anti-inflamatórias, analgésicas e antipiréticas devido à inibição da síntese da prostaglandina catalisada pela COX-2. Recentemente, este medicamento foi freqüentemente investigado por sua atividade anticancerígena, utilizando modelos in vitro e in vivo. Estudos pré-clínicos sobre celecoxib relataram atividade anticancerígena proeminente contra o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de cólon, câncer de mama e câncer de pulmão .
Neste trabalho foram desenvolvidos alginato e contas de alginato quitosano contendo celecoxib solubilizado em fase auto-sulsificante, a fim de obter um sistema de administração de drogas para administração oral, capaz de retardar a liberação da droga em ambiente ácido e promovê-la no compartimento intestinal. A lógica deste trabalho esteve ligada ao desejo de melhorar a eficácia terapêutica do celecoxib, reduzindo seus efeitos adversos gástricos e favorecendo seu uso na profilaxia do câncer de cólon e como adjuvante na terapia da polipose familiar. O objetivo do presente estudo foi a avaliação e a comparação das propriedades do celecoxib carregado de alginato de cálcio e dos grânulos de alginato de cálcio e quitosana. Foram investigados a morfologia, tamanho das partículas, comportamento de inchaço e desempenho de liberação de drogas in vitro de esferas em meios aquosos com pH diferente.
2. Materiais e Métodos
2,1. Materiais
Celecoxib foi obtido da Chemos GmbH (Regenstauf, Alemanha). Cloreto de cálcio anidro e alginato de sódio (peso molecular 120000-190000 g/mol; proporção de resíduos manurônicos-gulurônicos de 1,56) foram adquiridos da Sigma Aldrich (Milão, Itália), enquanto o quitosano de baixo peso molecular foi da Fluka (Milão, Itália). O Labrasol (caprilocaproyl macrogol-8 glicerídeos) foi um presente de Gattefossè (Milão, Itália); TPGS (D-α-tocopheryl polyethylenglycol 1000 succinate) foi gentilmente doado pela Isochem (Gennevillers, França). Todos os outros produtos químicos foram de grau analítico.
2.2. Preparação de contas de alginato de cálcio
Confecção de contas de alginato de cálcio foram preparadas pelo método de gelificação usando íons de cálcio como agente de ligação cruzada. Em detalhe, uma solução aquosa de 1,5% (p/p) de alginato de sódio foi misturada com uma fase auto-sulsificante carregada de droga na proporção de 4 : 1 e adicionada gota a gota a uma solução de 100 mM de CaCl2 . A fase auto-sulsificante foi preparada misturando quantidades pesadas de Labrasol e TPGS a 50°C e dissolvendo o celecoxib na solução excipiente. A emulsão (solução de alginato de sódio e fase auto-emulsificante) foi extrudida manualmente no banho de endurecimento através de agulhas com 400 ou 600 μm de diâmetro interno, sob agitação suave e constante, à temperatura ambiente. Após 15 minutos, as contas foram recolhidas, lavadas com água desionizada para eliminar o excesso de iões de cálcio e depois secas a 40ºC durante a noite. A composição das formulações preparadas, codificadas CAl 600 e CAl 400, foi listada na Tabela 1.
Tabela 1
Composição de alginato de cálcio e contas de alginato de cálcio-citosano.
2.3. Preparação das contas de Alginato-Calcário-ChitosanoConfecção das contas de Alginato-Calcário-Chitosano (identificadas como CAlCh 600 e CAlCh 400) foram preparadas de acordo com o método de um passo. O procedimento foi idêntico ao adoptado no caso das contas de alginato, com a excepção de que o banho de endurecimento foi uma solução de quitosano 0,2% (p/p) em ácido acético diluído (1%) contendo CaCl2 a uma concentração de 100 mM. A composição das formulações da quitosana foi relatada na Tabela 1. 2.4. Análise morfológica e granulométricaA morfologia dos grânulos úmidos e secos e o tamanho das partículas dos grânulos secos foram analisados usando um estereomicroscópio Motic SMZ168 e um software de análise de imagem (Motic Image Plus 2.0). Para cada formulação, o tamanho da partícula foi calculado como o valor médio do tamanho de 20 partículas secas. 2,5. Conteúdo de drogaSeis miligramas de esferas secas carregadas de droga foram solubilizadas em solução tampão fosfato (100 mL) a pH 6,8 adicionado de 0,75% (p/v) de laurissulfato de sódio a 70°C sob agitação por duas horas. Após resfriamento, as soluções obtidas foram filtradas e analisadas espectrofotometricamente a 255 nm; os resultados são a média de pelo menos três determinações. 2,6. Estudo de dilataçãoEstudos de dilatação foram realizados a 37°C em esferas secas colocadas em três meios aquosos caracterizados por diferentes pH: ácido clorídrico a pH 1,0 e tampão fosfato a pH 6,8 e pH 7,4, Quantidades de alginato de cálcio e esferas secas de alginato de cálcio e quitosano foram colocadas em frascos de vidro contendo 5 mL de cada fluido. Após intervalos de tempo fixos (5, 15, 30, 60, e 120 minutos), as amostras foram recuperadas, suavemente limpas com papel, e pesadas novamente. A variação dinâmica do peso dos grânulos em relação ao tempo, definido como grau de inchaço (Sw), foi calculado de acordo com a seguinte equação:onde está o peso dos grânulos no estado inchado no momento e é o peso inicial dos grânulos secos . 2,7. Celecoxib Release StudyOs estudos de liberação in vitro foram realizados em ácido clorídrico a pH 1,0 e em tampão fosfato a pH 6,8 e a pH 7,4 adicionado de laurissulfato de sódio 0,75% para garantir a manutenção das condições da pia. Os estudos foram realizados colocando quantidades precisas e pesadas de cada formulação, equivalentes a 8 mg de celecoxib, em 500 mL do fluido selecionado a 37°C sob uma taxa de rotação de 100 rpm (aparelho 2, palheta). As amostras filtradas foram retiradas em intervalos de tempo específicos sem substituição e analisadas para o conteúdo de celecoxib, utilizando um espectrofotômetro UV a 255 nm quando o fluido era HCl e tampão fosfato a pH 6,8 ou a 256 nm no caso de tampão fosfato a pH 7,4. Cada experimento foi feito em triplicata. Os desempenhos de liberação de alginato de cálcio e contas de alginato de cálcio e quitosano foram comparados usando os parâmetros de dissolução t10%, t50% e t90% que indicam os pontos de tempo em que 10%, 50% e 90% da droga foram liberados e o parâmetro de similaridade f2 . Para que curvas sejam consideradas similares, valores de f2 devem ser próximos a 100, e valores de f2 maiores que 50 (50-100) garantem uniformidade ou equivalência das duas curvas. 2,8. Análise estatísticaOs resultados foram analisados estatisticamente para testar diferenças significativas pelo teste t de Student, com intervalo de confiança de 95%; valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. 3. Resultados e DiscussãoGlinato e contas de algino-quitosano foram obtidos pelo método de gelificação ionotrópica, deixando cair uma emulsão, composta de solução aquosa de alginato e a carga de droga em fase auto-sulsificante, através de 23 G (600 μm) ou 27 G (400 μm) agulhas, em um banho gelificante de cloreto de cálcio ou clorido-quitosano de cálcio. Os excipientes seleccionados para a fase de auto-emulsificação foram o Labrasol, um componente líquido com propriedades auto-emulsificantes e melhoradores de solubilidade, e o D-α-tocopheryl polyethylenglycol 1000 succinate como agente coemulsificador e melhorador de absorção (Tabela 1). A composição da fase auto-emulsificante foi a mesma usada em um trabalho anterior . As imagensereomicroscópicas de alginato úmido e seco e grânulos de alginato quitosano são relatadas nas Figuras 1 e 2. Imediatamente após a preparação, as contas CAl 600 (Figura 1(a)) mostram forma regular e dimensões homogêneas; são brancas e opacas, com superfície lisa, brilhante e homogênea.  (a)  (b)  (c)  (d) (a) (b) (c) (d) Figura 1
Imagens estereomicroscópicas de húmido (a-b) (ampliação de 2x) e contas secas (c-d) (ampliação de 3x) obtidas com uma agulha de 600 μm de diâmetro.
 (a)  (b)  (c)  (d) (a) (b) (c) (d) Figura 2
Imagens estereomicroscópicas de húmido (a-b) (ampliação de 2x) e contas secas (c-d) (ampliação de 3x) obtidas com uma agulha de 400 μm de diâmetro.
O processo de secagem não altera a forma dos grânulos mas leva à redução das suas dimensões e modifica as características da sua superfície, que é irregular e enrugada (Figura 1(b)). A perda de água induz uma diminuição da distância entre as cadeias poliméricas e uma variação da estrutura dos grânulos, que não é compacta e contínua, mas composta de pequenos micronúcleos aderentes uns aos outros. As partículas de CAlCh 600 totalmente inchadas são ligeiramente amarelas e de forma bastante regular e apresentam uma superfície lisa (Figura 1(c)). Neste caso, o processo de secagem afeta a forma esférica das contas (Figura 1(d)); elas se tornam elipsoidais; suas dimensões diminuem e sua superfície é muito áspera. Além disso, após a secagem observa-se uma aglomeração parcial da superfície dos grânulos: é atribuível às propriedades adesivas do quitosano . No caso de contas preparadas com uma agulha 400 μm (Figuras 2(a)-2(c)), as imagens registradas imediatamente após a preparação comprovam que, para ambas as formulações (com ou sem quitosana), as partículas não são homogêneas em diâmetros, mesmo que sejam de forma regular. As contas secas de CAl 400 e CAlCh 400 (Figura 2(b)) têm uma superfície caracterizada por aspereza e concavidade; além disso, no caso da formulação com algino-chitosano, a forma da partícula é completamente irregular e a presença de pontes sólidas de quitosana é bem evidente, que ligam as contas impedindo sua separação. O tamanho médio das contas carregadas de celecoxib está entre 715 e 896 μm (Tabela 2). O diâmetro dos grânulos foi significativamente afetado pelo diâmetro da agulha utilizada durante a preparação (). A adição de quitosano aos grânulos de alginato altera significativamente as suas dimensões apenas quando a agulha 400 μm foi utilizada (). Além disso, como indicado pelos altos valores do desvio padrão, utilizando a agulha 400 μm o produto final é uma família de partículas não homogêneas em dimensões.
Tabela 2
Diâmetro médio e conteúdo de celecoxib dos grânulos secos.
Todas as formulações contêm alta quantidade de droga (Tabela 2) distribuída homogeneamente na matriz do excipiente e as diferenças entre seu conteúdo de droga não foram significativas, exceto para CAlCh 400 ligeiramente menor que as outras (). A percentagem de celecoxib nas esferas excede o valor teórico e isto deve-se à perda do Labrasol durante o tempo de cura, justificável considerando a alta afinidade entre este excipiente e a água que o expulsa das esferas para dentro do banho gelificante. Uma propriedade peculiar dos sistemas de micropartículas de alginato ou algino-quitosano na forma seca é a sua capacidade, após contacto com um fluido aquoso, de re-hidratar, absorver o fluido e sofrer um processo de inchaço, associado principalmente à hidratação dos grupos hidrofílicos de polímeros. Quando o fluido é água, penetra nas partículas que enchem os poros entre as cadeias poliméricas e provocam um importante inchaço do sistema, sem erosão/desintegração. Selecionando fluidos com pH diferente, o comportamento do inchaço dos grânulos pode mudar. Por esta razão, a capacidade de inchaço do alginato de cálcio e das esferas de alginato de cálcio e quitosano foi avaliada em HCl a pH 1,0 e em soluções tampão fosfato a pH 6,8 e 7,4 (Figuras 3-5). 
Figura 3
Grau de absorção em ácido clorídrico a pH 1,0.
> Figura 4
Grau de absorvência em tampão fosfato a pH 6.8.
Figura 5
Grau de absorção em tampão fosfato a pH 7,4.
Em ambiente ácido (Figura 3), não há diferenças na capacidade de inchaço das quatro formulações; a este pH, o grau máximo de inchaço não é superior a 60%. Os grânulos de alginato e algino-quitosano absorvem parte do líquido; o seu peso aumenta inicialmente e depois permanece constante. A este pH, para os sistemas de alginato (CAl 600 e CAl 400), os grupos de carboxilato do polímero localizado na superfície das partículas são protonados e forma-se uma camada de ácido algínico. A insolubilidade do ácido algínico neste fluido e a formação de ligações de hidrogênio, responsáveis por um aumento da estabilidade da estrutura, impedem a penetração de fluido adicional nas camadas mais profundas das partículas, limitando o seu inchaço. O mesmo comportamento de inchaço é observado para os sistemas CAlCh 600 e CAlCh 400. Mesmo que, em ambiente ácido, o quitosano seja altamente solúvel e carregado para a conversão de suas unidades aminas em forma solúvel NH3+, a interação de grupos amino e grupos carboxílicos protonados não é forte o suficiente para promover o inchaço. Assim, o comportamento limitado do inchaço total é dominado pela estrutura de alginato de cálcio. Figuras 4 e 5 mostram que as formulações apresentam alta capacidade de inchaço a pH 6,8 e pH 7,4. Para a formulação de CAl 600, o peso das partículas cresce rapidamente, atinge um pico após 30 minutos, e depois diminui abruptamente devido à erosão/desintegração do sistema. Este comportamento pode ser devido à reação de troca iônica entre Na+ (presente no tampão fosfato) e Ca2+ ligado a grupos carboxílicos de alginato. Os íons monovalentes substituem os bivalentes causando a quebra da estrutura da “caixa de ovos” e o aumento da distância entre as cadeias poliméricas e favorecendo a absorção do fluido e o inchaço dos sistemas. Este processo continua até que a pressão osmótica nos grânulos equilibre a força das ligações cruzadas e dos enredos físicos, que preservam a estrutura dos grânulos. Assim, as partículas começam a se desintegrar e seu peso diminui. Os resultados obtidos do estudo de inchamento evidenciam que os grânulos CAlCh 600 e CAlCh 400 são caracterizados por uma estrutura mais resistente em relação ao CAl 600 e CAl 400, provavelmente atribuíveis às interações entre o alginato e as cadeias de quitosana. O grau máximo de inchaço das esferas de quitosano é inferior ao do alginato; os sistemas algino-quitosano são capazes de alcançar um equilíbrio de inchaço em cerca de 30 minutos e manter o seu peso a um nível constante até ao final do teste. Provavelmente as interacções entre os dois polímeros são responsáveis pela formação de partículas com uma resistência mecânica considerável, o que limita a absorção do fluido e a desintegração da estrutura. Finalmente, comparando o comportamento de inchaço de CAl 400 versus CAl 600 e CAlCh 400 versus CAlCh 600 (mesma composição, diâmetro diferente da agulha utilizada no processo de preparação), é possível observar que nos buffers de fosfato CAl 400 e CAlCh 400 atingiram um pico máximo de inchaço maior que o de CAl 600 e CAlCh 600, respectivamente. Os perfis de liberação de fármacos obtidos das diferentes formulações a pH de 1,0, 6,8 e 7,4 são mostrados nas Figuras 6-8. A liberação in vitro de celecoxib é afetada pelo pH do fluido selecionado: a porcentagem de droga liberada em meio ácido em duas horas é bastante baixa e varia entre 12,70% e 24,53% (Figura 6). O atraso da liberação de celecoxib pode ser atribuído à reduzida capacidade de inchaço dos sistemas neste fluido; nem a composição dos grânulos nem o seu diâmetro afetam o desempenho da liberação da droga (valores do parâmetro f2 sempre acima de 50). A pH 1,0, o processo de liberação é regido apenas pela difusão do fármaco. Este resultado permite satisfazer o primeiro objetivo deste trabalho de pesquisa que é minimizar a liberação do medicamento em ambiente ácido para promover e favorecer este processo a nível intestinal. 
Figura 6
Perfis de liberação de ELECOXIB em ácido clorídrico a pH 1,0.
Figura 7
Perfis de liberação de ELECOXIB em tampão fosfato a pH 6.8.
Figura 8
Perfis de libertação deelecoxib em tampão fosfato a pH 7,4.
Em tampão fosfato a pH 6,8, as formulações são caracterizadas por um comportamento de liberação de fármacos afetados por sua composição e não significativamente por suas dimensões (Figura 7). Nesse fluido, os sistemas inicialmente incham e depois erodem/desintegram e, consequentemente, o processo de liberação do fármaco é impulsionado inicialmente pela difusão e, em seguida, pelo relaxamento polimérico. As esferas de alginato (CAl 600 e CAl 400) são capazes de completar a liberação de celecoxib em cerca de oito horas; pelo contrário, não mais de 75% da droga carregada em esferas de alginato quitosano passa em solução após o mesmo tempo. A comparação dos resultados das formulações de micropartículas de alginato e alginato-chitosano revela que os perfis não são semelhantes tendo valores de f2 inferiores a 50. Uma possível explicação para tal comportamento é a interação eletrostática entre os grupos carboxil do alginato e o grupo amino de quitosano que melhora a resistência mecânica da rede polimérica reduzindo seu inchaço e erosão a pH 6,8, Surprprisamente, a taxa de liberação de celecoxibe diminui principalmente para a formulação de CAlCh 400, mesmo que esta formulação seja caracterizada pelo menor tamanho de partícula. Provavelmente o pequeno diâmetro e a alta área de superfície dessas partículas levam à formação de uma camada mais espessa de quitosana ao redor dos grânulos, o que se opõe a uma grande resistência à absorção do fluido e, como consequência, à liberação do medicamento. A também a pH 7,4 as diferenças no desempenho da liberação do medicamento podem ser atribuídas à composição da formulação e não às dimensões das partículas (Figura 8). Todas as formulações mostraram uma taxa quase constante de liberação de fármacos. Não há diferenças entre CAl 600 e CAl 400 e entre as curvas de liberação de CAlCh 600 e CAlCh 400; quando o quitosano está nos grânulos, a taxa de liberação do medicamento diminui. As mesmas conclusões são mostradas pela análise dos resultados da liberação do medicamento através dos parâmetros de dissolução (t10%, t50%, e t90%) (Tabela 3). As diferenças no comportamento de liberação dos grânulos são detectadas também através dos parâmetros de dissolução t10%, t50% e t90% e são bem evidentes pelo tempo necessário para liberar 50 e 90% da droga carregada. Em soluções tampão fosfato, os grânulos de alginato quitosano requerem tempos mais longos para liberar 50 e 90% de celecoxib em comparação com os grânulos de alginato. Provavelmente a presença do complexo alginato-chitosano provoca um crescimento das rugas estruturais, irregularidade e complexidade da estrutura do grânulo, o que dificulta a libertação do fármaco.
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