Fungal Dimorphism and Virulence: Mecanismos Moleculares para Adaptação à Temperatura, Evasão Imune e Sobrevivência In Vivo

2 A transição de fase

A transição morfológica reversível entre hifas e leveduras, conhecida como transição de fase, é característica fundamental da biologia e estilo de vida dos fungos dimórficos. No solo (22-25°C), estes fungos crescem como hifas sépticas que produzem conidia. A ruptura do solo por actividades humanas como a construção ou desastres naturais pode aerossolizar conídios e fragmentos hifálicos. Quando inalados nos pulmões quentes de um hospedeiro mamífero (37°C), estes propágulos infecciosos convertem-se em levedura patogénica (ou esférulas para Coccidioides) para causar pneumonia. Uma vez estabelecida a infecção nos pulmões, a levedura (ou esférulas) pode se disseminar para outros órgãos como a pele, osso ou cérebro.

Embora a temperatura seja o estímulo predominante que influencia a transição de fase -hyphae a 22-25°C e levedura a 37°C, estímulos adicionais que impactam o interruptor dimórfico incluem a tensão de dióxido de carbono (CO2), cisteína exógena, e estradiol. A tensão elevada de CO2 (5% CO2) é necessária para a artroconidia de Coccidioides spp. germinar em esférulas a 37°C e para o crescimento opcional da levedura de Histoplasma capsulatum . No pulmão humano, a tensão de CO2 é aproximadamente 150 vezes maior do que o ar ambiente, o que fornece uma quantidade ideal de CO2 para a transição de fase . Em resposta a uma mudança de temperatura, a respiração mitocondrial cessa em Histoplasma, Blastomyces e Paracoccidioides . Para reativar a respiração e completar a mudança morfológica para levedura, a absorção de cisteína exógena é necessária . A produção de 17β-estradiol pelo homem influencia a mudança morfológica e o crescimento de Coccidioides e Paracoccidioides, que por sua vez, modula a gravidade da infecção nas mulheres. Na presença do 17β-estradiol, o crescimento de Coccidioides esférulas a 37°C é acelerado, o que pode explicar o aumento do risco de coccidioidomicose disseminada em mulheres grávidas . Além disso, a análise in vitro demonstrou que as esferulas de Coccidioides apresentam uma ligação saturável de 17β-estradiol . Ao contrário dos Coccidioides, a mudança morfológica de hifa ou conídio para levedura em Paracoccidioides é bloqueada pelo 17β-estradiol . Em um modelo murino de infecção pulmonar, a conversão de conídio em levedura é prejudicada em fêmeas, mas não em ratos machos . Em humanos, a incidência de paracoccidioidomicose é 11-30 vezes maior em homens adultos do que em mulheres adultas, apesar da frequência similar de exposição a Paracoccidioides. Antes da puberdade, a relação macho-fêmea é 1 : 1 .

Estas observações estimularam a investigação dos mecanismos pelos quais o estradiol e o gênero influenciam o desenvolvimento fúngico e a resposta do hospedeiro. A análise do microarray de expressão gênica da cepa P. brasiliensis Pb01 demonstrou que a conversão deficiente para levedura a 37°C na presença de 17β-estradiol reduziu a transcrição de genes envolvidos com a sinalização celular (pequena GTPase RhoA, palmitoyltransferase), choque térmico (HSP40, HSP70 e HSP90), síntese de quitina (quitina-sintase) e remodelação de glucan (β-1,3-glucan-sintase, α-1,3-glucan-sintase). Quando estimulada com paracocina, uma proteína de ligação à lectina com atividade de quitinase, ratos fêmeas exibem uma resposta mais forte de citocina Th1 com aumento da produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (INF-γ) e interleucina 12 (IL-12), juntamente com aumento da atividade fungicida de macrófagos quando comparada a ratos machos . Após a ooforectomia e tratamento com testosterona, a resposta das citocinas mudou de Th1 para Th2 em camundongos fêmeas. A castração de camundongos machos associada à terapia com estradiol favoreceu uma resposta de citocinas Th1 em vez de uma resposta de citocinas Th2 . Coletivamente, estes achados destacam a importância dos hormônios esteróides sexuais e gênero no desenvolvimento fúngico e suscetibilidade do hospedeiro.

3. Fatores de Virulência Fase-Este e Subversão das Defesas Imunes hospedeiras

Onse inalados nos pulmões, as conidias são ingeridas por macrófagos, onde germinam em leveduras (ou esférulas para Coccidioides) e se replicam. Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis e posadasii, Sporothrix schenckii, Paracoccidioides brasiliensis e lutzii, e Talaromyces marneffei se replicam dentro e fora das células imunes inatas. Tradicionalmente, pensava-se que as Blastomyces spp. eram exclusivamente extracelulares; contudo, pesquisas recentes demonstram que a B. dermatitidis conidia ingerida por macrófagos sobrevive e se converte em levedura.

Durante a transição de fase, os fungos dimórficos térmicos upregulam genes específicos da fase de levedura incluindo a adesão-1 de Blastomyces (BAD-1), a proteína-1 de ligação ao cálcio (CBP1), a fase de levedura específica-3 (YPS3), e a glicoproteína da parede externa da esférula (SOWgp) para subverter ativamente as defesas imunológicas do hospedeiro. B. dermatitidis e B. gilchristii express BAD1 (anteriormente WI-1), uma proteína de 120 kDA secretada e multifuncional serve como uma evasina adesiva e imunológica. O BAD1 secreto liga-se de volta à superfície da célula de levedura através de interações com a quitina e também permanece solúvel no meio extracelular. O BAD1 ligado à superfície celular liga a levedura às células hospedeiras através de receptores complementares (CR3, CD14) e sulfato de heparano para promover a adesão da célula de levedura às células hospedeiras. A BAD-1 ligada à superfície celular da levedura inibe a produção de TNF-α por macrófagos e neutrófilos de forma transformadora, dependente do fator de crescimento-β (TGF-β). Em contraste, o BAD-1 solúvel bloqueia a produção de TNF-α independentemente do TGF-β . A TNF-α é uma citocina crítica para uma defesa adequada do hospedeiro contra os fungos dimórficos. A neutralização da TNF-α em um modelo murino de infecção resulta em blastomicose pulmonar progressiva. Além disso, em 2008, a Food and Drug Administration (FDA) emitiu um aviso de risco aumentado de histoplasmose, blastomicose e coccidioidomicose para pessoas com inibidores de TNF-α para o tratamento de doenças auto-imunes (por exemplo, artrite reumatóide e doença de Crohn). Além de afetar a produção de TNF-α, o BAD1 também prejudica a resposta imune adaptativa ao inibir a ativação de linfócitos T CD4+, o que diminui a produção de IL-17 e INF-γ . A adesão e as atividades imunomoduladoras do BAD1 são essenciais para a patogênese da Blastomicose. A eliminação de BAD1 torna a levedura Blastomyces avirulenta no modelo murino de infecção pulmonar . Além da BAD1, a Blastomyces dermatitidis secreta uma dipeptidyl-peptidase IVA (DppIVA) para modular a imunidade do hospedeiro. A DppIV é uma protease serina que clivagem GM-CSF, uma potente citocina que ativa macrófagos e neutrófilos para matar fungos . Silenciar DppIVA por interferência RNAi (RNAi) reduz a sobrevivência da levedura B. dermatitidis coculturada com macrófagos e neutrófilos ativados por GM-CSF. Além disso, as cepas de DppIVA-RNAi têm atenuado a virulência durante a infecção pulmonar . Em contraste com B. dermatitidis, H. capsulatum DppIVA não é detectado extracelularmente e não contribui para a virulência .

Analógico a BAD1, Coccidioides SOWgp é localizado à superfície da célula esférica e um importante fator de virulência. O SOWgp facilita a ligação de esférulas para hospedar proteínas de matriz extracelular (ECM) incluindo laminina, fibronectina, e colágeno . A eliminação de SOWgp (SOWgp∆) em Coccidioides prejudica a aderência da esferula às proteínas ECM e resulta em virulência atenuada em um modelo murino de infecção pulmonar .

Em H. capsulatum, CBP1 é um fator de virulência secretado que promove a replicação intracelular da levedura . O CBP1 liga o cálcio, existe como homodímero, é resistente à degradação da protease e está estruturalmente relacionado a um grupo de proteínas de ligação lipídica de membrana conhecidas como saposinas . A CBP1 secretada pela levedura intracelular H. capsulatum induz apoptose de macrófagos e lise, induzindo a transcrição de caspases de células hospedeiras, fatores de transcrição (NUPR1/p8, TRB3), e genes envolvidos com estresse reticulado endoplasmático (ER) . Assim, a lise de macrófagos é um processo ativo dirigido pelo fungo e não devido à elevada carga fúngica intracelular. Semelhante ao BAD1, a CBP1 é um fator de virulência essencial. Os mutantes nulos CBP1 (CBP1Δ) são incapazes de induzir apoptose de macrófagos e são avirulentos no modelo murino de infecção pulmonar . Além do CBP1, H. capsulatum segrega YPS3, que se liga novamente à quitina na parede celular da levedura e facilita a disseminação extrapulmonar para o fígado e baço .

Durante a mudança morfológica de hifa para levedura ou conídio para levedura, fungos dimórficos passam por extensa remodelação da parede celular, incluindo a composição glucana. A reorganização do conteúdo de glucano tem o potencial de impedir o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) pelas células imunes hospedeiras. Durante a mudança morfológica, a quantidade de β-(1,3)-glucan na parede celular de Blastomyces e Paracoccidioides diminui de ≈40% em hifas para ≈5% em leveduras. A redução de β-(1,3)-glucan na parede celular da levedura pode limitar o seu reconhecimento pela dectina-1 em células imunes inatas e lectinas aglutinantes de manose . Em contraste, H. capsulatum não reduz β-(1,3)-glucan em células de levedura, mas usa α-(1,3)-glucan como “escudo” para bloquear o reconhecimento da dectina-1 em β-(1,3)-glucan . Assim, os fungos dimórficos utilizam múltiplas estratégias incluindo fatores de virulência secretados e modificação da parede celular da levedura para subverter as defesas imunológicas do hospedeiro para estabelecer infecção inclusive em pessoas com sistemas imunológicos intactos.

A capacidade dos fungos dimórficos térmicos de subverter as defesas imunológicas do hospedeiro não é 100% eficaz. O hospedeiro pode montar uma resposta imunológica para parar a progressão da infecção. Estudos epidemiológicos demonstraram que ≈50% das pessoas expostas a Blastomyces spp. desenvolvem infecção sintomática, enquanto ≈50% tem infecção assintomática ou subclínica. Similarmente, a inalação de Histoplasma capsulatum, Coccidioides spp. e Paracoccidioides spp. resulta em infecção sintomática em <10%, 33-50%, e <5% de pessoas saudáveis, respectivamente . Defesas imunitárias inatas e adaptativas inatas, juntamente com a capacidade de “murar” leveduras em granulomas, são críticas para a defesa do hospedeiro contra a infecção. Após a conversão de conidia em levedura, células dendríticas e macrófagos interagem com e envolvem células de levedura. A análise da expressão gênica das células dendríticas que têm levedura fagocitótica de P. brasiliensis demonstrou upregulação de transcrições envolvidas na geração de uma resposta imune protetora incluindo TNF-α, IL-12, e quimiocinas (CCL22, CCL27, e CXCL10) . Além disso, o receptor de dectina-1 foi upregulado, o que induz fagocitose, geração de espécies reativas de oxigênio e citoquinas e quimiocinas pró-inflamatórias em resposta à ligação β-(1,3)-glucan . As quimiocinas promovem a migração de leucócitos para locais de infecção . Da mesma forma, macrófagos infectados com P. brasiliensis também induzem uma resposta pró-inflamatória com upregulação de TNF-α, quimiocinas (CCL21, CCL22, CXCL4, CXC11 e CXCL14), e quinases (IRAK2) . Estes achados destacam a capacidade das defesas imunológicas em limitar o impacto dos fatores de virulência fúngica.

4. Regulação da transição de fase

A transição de hifas ou conídios para leveduras a 37°C é essencial para a virulência. A descoberta de uma histidina quinase híbrida codificada por DRK1 em Blastomices e Histoplasma forneceu a primeira prova genética de que a mudança morfológica para a levedura está diretamente ligada à virulência . DRK1 nulo (DRK1Δ), mutantes de inserção e interferência do RNA – (RNAi-) cepas silenciadas crescem como hifas a 37°C em vez de leveduras, não conseguem upregular fatores de virulência específicos da fase de levedura, como BAD1 e CBP1, e são avirulentas em um modelo murino de infecção . A função do DRK1 é conservada entre os fungos dimórficos térmicos. Em T. marneffei, o DRKA (um homólogo DRK1) é crítico para a conversão de conídios em leveduras em macrófagos . Em Sporothrix, Paracoccidioides e T. marneffei, a abundância transcrita de DRK1 é maior em leveduras (37°C) do que em hifas (25°C) . Prevê-se que o DRK1 funcione como parte da cascata de sinalização de glicerol de alta osmolaridade (HOG), o que facilita a adaptação às tensões osmóticas, oxidativas e de temperatura . Assim, a transcrição do DRK1 também não é preestabelecida em resposta à tensão osmótica em Paracoccidioides e T. marneffei . Além de facilitar a adaptação à temperatura e às tensões osmóticas, o DRK1 também influencia a integridade da parede celular .

Regulação da mudança morfológica é complexa e não se limita ao DRK1. Os fatores de transcrição codificados pelo RYP1-4 (necessários para a fase de levedura) também governam a transição de fase e regulam um conjunto de genes específicos da fase de levedura envolvidos na virulência a 37°C. Estes fatores de transcrição são upregulados a 37°C e são conservados entre fungos dimórficos e filamentosos. RYP1 é um homólogo do regulador mestre WOR1 em C. albicans, enquanto RYP2 e RYP3 são parte do complexo de veludo, VosA e VelB, respectivamente. RYP4 é uma proteína Zn(II)2Cys6 de zinco binuclear de domínio de cluster que é homóloga a A. nidulans FacB; entretanto, não parece estar envolvido na utilização de acetato . Estes fatores de transcrição formam uma rede integrada na qual se ligam e regulam diretamente um conjunto comum de genes centrais, incluindo aqueles importantes para a virulência, como o CBP1 e o YPS3 . A transcrição silenciosa do RYP1-4 resulta em células que não passam corretamente pela transição de fase e crescem como hifas a 37°C .

A chave morfológica na direção oposta, levedura para hifas, também é importante para a patogênese. O crescimento como hifas promove a sobrevivência no ambiente, a geração de conídios para facilitar a transmissão a novos hospedeiros, e a diversidade genética através do acasalamento. B. dermatitidis SREB e H. capsulatum SRE1 codificam um fator de transcrição GATA que rege a transição para hifas após uma queda na temperatura de 37°C para 22-25°C . Os mutantes nulos SREB (SREBΔ) e as estirpes SRE1-RNAi não completam a conversão para hifas . O papel deste fator de transcrição GATA na adaptação à temperatura é conservado em outros fungos. Um homólogo do SREB e SRE1 em C. neoformans, CIR1, é essencial para a termotolerância a 37°C . Em B. dermatitidis, o defeito do interruptor morfológico corresponde a uma diminuição da biossíntese dos lípidos neutros (ergosterol, triacilglicerol) e das gotículas lipídicas . A suplementação com ácidos gordos saturados exógenos (ácido palmítico, 16 : 0, e ácido esteárico, 18 : 0) corrigiu parcialmente os defeitos na morfogénese e formação de gotículas lipídicas . Isto sugere que o metabolismo dos lipídios neutros tem que potencialmente influenciar a transição de fase para hifas à temperatura ambiente. SREB e SRE1 também atuam como reguladores negativos dos genes envolvidos na biossíntese dos sideróforos e na absorção de ferro; entretanto, esse papel parece ser independente da transição de fase . Em H. capsulatum, a eliminação de VMA1, que codifica uma ATPase vacuolar envolvida com homeostase intracelular de ferro, resulta em células que não conseguem converter para hifas a 25°C. Isto indica o potencial do metabolismo do ferro não regulado pela SREB afectar o interruptor morfológico dependente da temperatura. Em T. marneffei, a conversão para hifas e manutenção da morfologia filamentosa a 25°C é governada por fatores de transcrição codificados por HGRA e TUPA, respectivamente . Além dos reguladores transcripcionais, a N-acetilglucosamina (GlcNAc) acelera a conversão de leveduras em hifas em B. dermatitidis e H. capsulatum via transmembrana transmembrana NGT1 e NGT2 .

5. Em Vivo Transcriptional Profiling

O uso de estratégias genéticas avançadas como a mutagênese insercional avançou substancialmente o campo da micologia médica em relação aos fungos dimórficos térmicos. Isto levou à descoberta de novos genes e redes de genes que regulam a transição de fase (por exemplo, DRK1, RYP1-3, e SREB). Na era dos estudos de associação de todo o genoma, um reservatório inexplorado para descobrir novos genes ou redes de genes nos fungos dimórficos é o perfil transcripcional da levedura durante a infecção. Para identificar genes importantes para a patogenicidade, foi realizado o perfil de transcrição in vivo da cepa Blastomyces dermatitidis 26199 usando um modelo murino de infecção pulmonar. Foi desenvolvida uma nova técnica em dois passos para separar eficazmente a levedura de B. dermatitidis do tecido pulmonar murino para obter RNA de alta qualidade para o sequenciamento do RNA (RNA-Seq) . Para identificar genes de B. dermatitidis com transcrição alterada independentemente da temperatura ou outras condições, o perfil transcripcional da levedura isolada dos pulmões de camundongos foi comparado com levedura coculurada com macrófagos a 37°C, levedura cultivada in vitro sem macrófagos derivados da medula óssea a 37°C, e hifas a 22°C usando a análise de aglomerado de K significa K. Esta análise identificou 72 genes que foram upregulados in vivo >2 vezes e independentemente da temperatura, cocultivo de macrófagos e condições de meio. Um subconjunto desses genes incluiu aqueles que codificam proteínas secretadas no meio extracelular, captação e transporte de cátions metálicos e metabolismo de aminoácidos .

Genes envolvidos com a aquisição de zinco são upregulados pela levedura B. dermatitidis durante infecção pulmonar. Isto inclui um zincóforo (PRA1/ZPS1), um transportador de zinco de alta afinidade (ZRT1) e um transportador de zinco de baixa afinidade (ZRT2) . Na Candida albicans, o PRA1 é secretado no ambiente extracelular para ligar o zinco e entregá-lo ao fungo através de sua interação com o ZRT1 na superfície celular . Em C. albicans, Aspergillus fumigatus, e Ustilago maydis, PRA1 e ZRT são coregulados e sintéticos. Embora PRA1 e ZRT1 pareçam ser coregulados em Blastomices, estes genes não são sinténicos. Surpreendentemente, a PRA1 não está bem conservada entre os fungos dimórficos e está ausente nos genomas de H. capsulatum, Paracoccidioides spp. e Emmonsia; contudo, homólogos estão presentes em Coccidioides. Em C. albicans, a PRA1 é postulada para impactar a patogênese. A eliminação da PRA1 resulta em mutantes que têm capacidade reduzida de lise das células endoteliais sob condições de zinco-deplete. O impacto da PRA1 durante a infecção in vivo ainda não foi investigado.

Além dos mecanismos de remoção do zinco in vivo, B. dermatitidis aumenta a transcrição da NIC1, que codifica um transportador de níquel . O níquel é necessário para a função adequada da urease, uma enzima que catalisa a conversão da ureia em amônia e CO2. A ureia é encontrada nos tecidos de mamíferos como produto do catabolismo dos nucleotídeos puros . Em Coccidioides, a urease é liberada das esférulas durante a replicação e danifica o tecido através da produção de amônia, que alcaliniza o microambiente. A eliminação do gene da urease (UREΔ) em C. posadasii resulta em virulência atenuada no modelo murino de infecção pulmonar. Em locais de infecção pulmonar, as células UREΔ são incapazes de catabolizar a uréia no tecido pulmonar e não conseguem baixar o pH (pH do tecido 7,2 para UREΔ contra pH 7,7 para o tipo selvagem). Além disso, os ratos infectados com o mutante nulo apresentaram uma resposta imunológica mais organizada com granulomas bem formados encapsulando as células UREΔ . Em Cryptococcus neoformans, NIC1 e URE1 contribuem para a invasão do cérebro. A eliminação de ambos os genes resulta na diminuição da capacidade das células de levedura NIC1Δ e URE1Δ de penetrar no sistema nervoso central. A URE1 também contribui para a patogênese do Cryptococcus gattii, que causa principalmente a infecção pulmonar sem uma predileção maior pela invasão do SNC em modelos animais . C. gattii URE1Δ tem atenuado a virulência durante a infecção pulmonar, reduziu a capacidade de disseminação à corrente sanguínea e prejudicou a replicação intracelular dentro dos macrófagos .

Infecção pulmonar duradoura, B. dermatitidis upregula dioxigenases envolvidas no catabolismo dos aminoácidos . Isto inclui a 4-hidroxifenilpiruvate dioxygenase (4-HPPD, HpdA), homogênea 1,2-dioxigenase (HmgA), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) e cisteína dioxigenase (CDG). HpdA e HmgA são conservados entre os fungos dimórficos e estão localizados em um cluster genético. Embora o papel preciso da HpdA e HmgA não seja conhecido em B. dermatitidis, pesquisas sobre T. marneffei iluminaram como estes genes envolvidos com o catabolismo da tirosina influenciam a patogênese. Os mutantes nulos HpdA e HmgA são hipersensíveis ao estresse oxidativo e têm prejudicado a germinação de esporos para leveduras em murinos e macrófagos humanos. A inibição da atividade do 4-HPPD parece ser importante para a mudança morfológica dependente da temperatura. A inibição química do 4-HPPD por NTBC (2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-ciclohexano-1, 3-diona) em T. marneffei e P. brasiliensis bloqueia a conversão de conidia ou hifa em levedura após um aumento da temperatura de 25°C para 37°C .

O papel do IDO fúngico na degradação do triptofano é mal compreendido; entretanto, as células tumorais upregulam o IDO para degradar o triptofano no microambiente para escapar das células imunes do hospedeiro . A infecção pulmonar com H. capsulatum e P. brasiliensis induz o IDO do hospedeiro, que reduz o crescimento fúngico, inibe a diferenciação linfocitária Th17 T e limita a inflamação excessiva dos tecidos .

Além da cisteína dioxigenase (CDG), B. dermatitidis upregula a cisteína sintetase A (CSA) e uma bomba de efluxo sulfito (SSU1) durante a infecção pulmonar . A CSA codifica uma enzima envolvida com a biossíntese de L-cisteína a partir da acetil-L-serina. A CDG decompõe a L-cisteína em ácido L-cisteína sulfônico que pode ser catabolizado para piruvato e sulfito. O sulfito de acumulação é potencialmente tóxico para as células e é secretado através de uma bomba de efluxo codificada por SSU1. Em C. albicans, a eliminação do CDG1 e SSU1 prejudica o desenvolvimento hifálico na presença de cisteína e CDG1Δ, mas não SSU1Δ, e atenua a virulência durante a infecção murina . Em dermatófitos como Arthroderma benhamiae, o catabolismo da cisteína para sulfitar por CDO1 seguido de efluxo de sulfito no ambiente extracelular por SSU1 é postulado para promover a quebra de queratina para facilitar o crescimento fúngico . A. benhamiae CDO1 e SSU1 mutantes nulos têm a capacidade de crescer em substratos ricos em queratina, tais como cabelos e unhas . Com base nestes dados, existe um potencial que a quebra da secreção de cisteína e sulfito poderia promover o crescimento de levedura Blastomyces na pele, que é abundante em queratina e o local mais comum para disseminação extrapulmonar.

6. Conclusões

Os fungos dimórficos térmicos são um grupo único de ascomicetos capazes de infectar pessoas com defesas imunitárias intactas e prejudicadas. Sua capacidade de adaptação à temperatura corporal central (37°C) e transição para a morfologia da levedura é essencial para a virulência. A mudança morfológica para a levedura está associada à upregulação de factores específicos de virulência que promovem a adesão aos tecidos hospedeiros, crescimento e lise dos macrófagos, respostas embotadas de citocinas adequadas, e prejudicam a imunidade mediada por células. A regulação da transição reversível entre hifas e leveduras requer que estes fungos se adaptem e respondam a numerosos estímulos, incluindo a temperatura, tensão de CO2 e hormônios sexuais. O perfil transcripcional in vivo começou a descobrir genes previamente não reconhecidos importantes para a propagação e virulência no hospedeiro mamífero.

Conflitos de interesse

O autor declara que não tem conflitos de interesse.