— FRAPcms

FRAP é um método de microscopia de fluorescência para estudar a mobilidade de moléculas marcadas com fluorescência em células vivas. É aplicado para a análise da difusão de moléculas dentro da célula, fluidez de membranas biológicas e ligação de proteínas.

Princípio:

FRAP pode ser conduzido usando um microscópio confocal moderno. Necessita de rotulagem fluorescente da molécula de interesse, por exemplo, por um anticorpo marcado com GFP. Uma experiência típica de FRAP envolve três fases distintas. Em primeiro lugar, a fluorescência inicial é medida na região de interesse. Em seguida, as moléculas fluorescentes são fotobleached dentro de uma área selecionada. Isto é feito focalizando o raio laser na respectiva área, levando à iluminação intensa e à extinção dos fluoróforos. Como resultado, pode ser observada uma área escura na amostra que, de outra forma, seria fluorescente. Finalmente, moléculas fluorescentes do entorno podem se difundir através da amostra e trocar as moléculas fotocopiadas por moléculas intactas. Esta recuperação da fluorescência é medida ao longo do tempo.

Desde que muitos factores podem influenciar a cinética de recuperação, os experimentos FRAP têm que ser bem planeados e os dados resultantes têm que ser analisados cuidadosamente. É então possível obter o coeficiente de difusão e os parâmetros de mobilidade das moléculas usando modelagem matemática.