EzColocalização: Um plugin ImageJ para visualização e medição da colocalização em células e organismos

Visão geral do fluxo de trabalho do EzColocalization

O fluxo de trabalho do EzColocalization é dividido em quatro módulos, cada um com sua própria guia na GUI. As abas são: (i) “Inputs” onde imagens, máscaras ou listas de regiões de interesse (ROI) são selecionadas e alinhadas; (ii) “Cell Filters” onde células podem ser selecionadas com base em características físicas e intensidade do sinal; (iii) “Visualization” onde mapas de calor, gráficos de dispersão e matrizes métricas (definidas abaixo) são criados; e (iv) “Analysis” onde as métricas e saídas de colocalização são escolhidas. Nem todos os módulos e nem todos os processos dentro de um módulo têm de ser utilizados. Algumas abas têm um botão “Preview” para executar um módulo específico ao invés do botão “Analyze” que executa todos os processos selecionados em todos os módulos.

Inputs

Image files, que são escolhidos na aba “Inputs” (Fig. 1A), devem ser: (i) monocromáticos (ou seja, não nos formatos RGB ou CMYK); (ii) de 8 bits, 16 bits ou 32 bits; e (iii) em um formato como o TIFF que mantém os valores originais de intensidade de pixels. Imagens grandes podem ser comprimidas para transferência de arquivos usando um formato sem perdas, como ZIP ou LZW, e depois descomprimidas para análises. Além das imagens, a EzColocalização pode aceitar máscaras e listas ROI para identificação de células (veja abaixo). Se houver múltiplas imagens para cada canal, as imagens devem ser empilhadas para uma análise mais eficiente no menu “Stack” (veja o guia ImageJ para mais detalhes24). As imagens numa pilha podem ser diferentes campos de visualização ou uma série temporal, mas devem ter as mesmas dimensões, magnificação e ordem de imagem para cada canal. O separador “input” também fornece opções para definir limiares para a intensidade do sinal e alinhar imagens desalinhadas de diferentes canais (Fig. 1B e Informação Complementar). As recomendações para aquisição de imagens adequadas para análise de colocação são fornecidas nas Informações Suplementares. Nota: o alinhamento opera no pressuposto de que um limiar apropriado para a intensidade do sinal pode ser escolhido para distinguir pixels dentro e fora das células; se o limiar incluir áreas fora da célula ou apenas uma área limitada dentro das células, então o alinhamento pode não funcionar corretamente. Por esta razão, todos os alinhamentos devem ser verificados visualmente, examinando os ROIs para confirmar que as áreas apropriadas da célula são selecionadas.

EzColocalização é projetada principalmente para um canal de “identificação da célula” e duas ou três imagens do canal “repórter”. Entretanto, ela pode operar com outras combinações de entrada (Tabela S1). O canal de identificação de células é usado para identificar células individuais e, consequentemente, para distinguir pixels intracelulares e extracelulares. O canal de identificação celular pode ser qualquer tipo de imagem que permita identificar os limites da célula, incluindo: imagens de microscopia leve (por exemplo, contraste de fase25,26 e campo brilhante), imagens com um repórter que rotula a membrana celular ou que está em todo o citoplasma (por exemplo, Cy5, Fig. 1B), e imagens com um corante extracelular que delineia as células. Imagens com contraste de interferência diferencial (DIC) criam sombras que dificultam a seleção automática de células usando métodos de limiar27; portanto, para imagens DIC recomendamos que ROIs sejam criadas usando as “ferramentas de seleção” no ImageJ para delinear manualmente as áreas das células, e então adicioná-las a uma lista escolhendo “Adicionar ao Gerenciador” (no submenu “Seleção” do menu “Editar”). Uma vez selecionados os ROIs para todas as células de interesse em uma imagem, uma máscara binária pode ser criada usando as funções “Clear Outside” e “Autothreshold” do ImageJ.

Cell Filters

A aba “Cell Filters” é usada para ajudar a selecionar células em imagens (Fig. 2A) e distinguir pixels intracelulares e extracelulares. As células são identificadas por: (i) escolhendo um dos algoritmos de limiares do ImageJ24, ou selecionando manualmente os limiares (o que é feito selecionando “*Manual*” em uma lista suspensa na guia Inputs e pressionando o botão “Show threshold(s)”), para identificar regiões correspondentes a células no canal de identificação de células (Fig. 2A). 2B); (ii) utilizando a segmentação da bacia hidrográfica para separar objetos em contato com as imagens do canal de identificação de células (opcional) (Fig. 2B); (iii) selecionando objetos das imagens do canal de identificação de células com base em parâmetros físicos (Fig. 2C) e intensidade do sinal (Fig. 2D). A EzColocalização tentará detectar automaticamente se as imagens de entrada têm fundo escuro ou claro, usando a obliquidade. Assumindo que há mais pixels no fundo do que nas células, uma imagem com inclinação positiva indica um fundo escuro e uma inclinação negativa indica um fundo claro. Os usuários também podem selecionar manualmente se as imagens de entrada têm fundo escuro ou claro nas opções “Parâmetros…” do menu “Configurações”. Células que estão apenas parcialmente dentro de uma imagem, e portanto poderiam fornecer valores enganosos, são automaticamente removidas das análises.

EzColocalização tem um “Pre-watershed filter” opcional e oito filtros pós-watershed opcionais (com a opção de selecionar mais). A segmentação da bacia hidrográfica pode auxiliar na separação das células divisoras e em contato28 , mas também pode dividir grandes objetos como agregados de material extracelular em fragmentos menores, do mesmo tamanho que as células. Para evitar este último, o filtro de pré-bacia hidrográfica pode ser usado para excluir objetos com grandes áreas da análise. O botão Preview na aba Cell Filters permite aos usuários ver quais objetos na imagem atual serão selecionados quando os limites mínimo e máximo de todos os filtros forem ajustados. Existem duas classes de parâmetros para os filtros de células pós-watershed (Tabela S2): (i) parâmetros físicos baseados em medições do canal de identificação de células; e (ii) parâmetros de intensidade de sinal dos canais de comunicação. Os parâmetros físicos se aplicam a todos os canais, enquanto que os parâmetros de intensidade de sinal se aplicam apenas ao canal relator para o qual são selecionados (porque os relatores podem ter níveis de sinal muito diferentes). Além da filtragem baseada em opções predefinidas no ImageJ, o EzColocalization possui filtros para a “MeanBgndRatio” ou “MedianBgndRatio”, que são calculados dividindo a intensidade média ou mediana do sinal de pixels dentro de um objeto pela respectiva intensidade média ou mediana do sinal de pixels extracelulares.

Visualização

O separador “Visualização” exibe sinais ou métricas nas células como: (i) “heat maps”; (ii) scatterplots; e (iii) “metric matrices” (Fig. 3A).

Heat maps são imagens pseudo-coloridas que mostram a magnitude relativa dos sinais do repórter (Fig. 3B). Eles são gerados por normalização e redimensionamento de modo que os valores mínimo e máximo de pixels sejam 0 e 255 respectivamente em cada célula, imagem, ou pilha. Existem oito opções para colorir os mapas de calor, e os valores de intensidade para cada cor são obtidos a partir da função “Mostrar LUT” (dentro do submenu “Cor” do menu “Imagem” no ImageJ). Os mapas de calor das células são adequados para determinar onde cada repórter ocorre com maior intensidade nas células. Os mapas de calor de imagem podem mostrar se células diferentes dentro de um campo de visão têm intensidades substancialmente diferentes, o que pode indicar heterogeneidade biológica ou irregularidade na etiquetagem. Os mapas de calor da pilha podem mostrar se células em imagens diferentes têm níveis substancialmente diferentes de intensidade de sinal, o que pode indicar irregularidade na etiquetagem ou medições através de uma lâmina (por exemplo, devido à fotocópia) ou alterações no sinal ao longo do tempo (se a pilha for uma série temporal). Nota: as aparências do mapa de calor são afetadas pelas configurações de brilho e contraste.

Scatterplots mostram a relação entre a intensidade do sinal para dois ou três canais de repórter para células e imagens individuais (Fig. 3C). Esta relação é importante na escolha da métrica de colocalização apropriada (Informação Complementar). Os gráficos de dispersão também podem revelar heterogeneidade nos padrões de localização8, que podem exigir a remoção de pixels de fundo ou análises separadas para diferentes tipos de células.

Matrizes métricas fornecem uma visão geral dos padrões de localização, mostrando os valores calculados de uma métrica de colocalização para muitas combinações de limiares. As matrizes métricas para a pontuação de sobreposição de limiares (TOS) têm se mostrado úteis para a análise de padrões de localização para dois canais de comunicação8,15 (Fig. 3D). Para completar, o EzColocalization tem a opção de calcular matrizes métricas para dois canais de comunicação usando outras cinco métricas: escore de sobreposição de limiar com escala logarítmica8, coeficiente de correlação de Pearson (PCC), coeficientes de colocação de Manders (M1 e M2), coeficiente de correlação de classificação de Spearman (SRCC) e quociente de correlação de intensidade (ICQ)8,15. A colocação para três canais também pode ser medida usando ICQ, coeficientes de colocação de Manders e TOS29 (Supplementary Information).

Thresholds for all metrics are measured as the top percentile (FT) of pixels for signal intensity8,15. Por exemplo, FT = 0,1 é o 10% de pixels com o sinal mais alto. Para as matrizes métricas, a FT também é usada para especificar o tamanho do passo para as combinações de limiares. Ou seja, FT = 0,1 também seleciona os limiares para os 10%, 20%, …, e 100% dos pixels com o sinal mais alto. Se o FT não dividir uniformemente em 100, então a porcentagem restante é o tamanho da última etapa. Para métricas que não precisam de um limiar (ou seja, PCC, SRCC e ICQ) os valores são calculados assumindo que apenas os pixels acima dos limiares existem. A janela da matriz métrica tem opções para os resultados a serem salvos como texto ou imagem, para alterar o FT ou tipo de métrica, para visualizar os valores individuais da métrica das células como uma lista e para calcular a média, mediana ou modo da métrica para cada combinação de limiar. Os botões “Proc” (processado) e “Raw” determinam se a lista de dados exibida, copiada ou salva com os botões “List”, “Copy” ou “Save…” respectivamente é o valor médio da amostra para cada combinação de limiar (por exemplo, valor mediano) ou todos os valores para cada célula da amostra para todas as combinações de limiar.

Análise

O separador “Análise” tem três subtabs (“Analysis Metrics”, “Metrics Info” e “Custom”). A subficha “Analysis Metrics” tem seis métricas para medir a colocação para dois repórteres (Fig. 4A) e três métricas para três repórteres (ver seção anterior). Os usuários podem escolher um limiar ou nenhum limiar para PCC, SRCC e ICQ. Os coeficientes de colocação de TOS e Manders devem ter um limite a ser calculado. A subficha Metrics Info contém informações e recursos sobre as métricas utilizadas na subficha Analysis Metrics (mais detalhes na Informação Complementar). Os limiares podem ser selecionados usando o método de Custos30 ou manualmente. Na subguia Personalizada (consulte Informações suplementares para obter informações adicionais), os usuários podem escrever seu próprio código em JavaTM para analisar imagens (nota: o exemplo fornecido é para calcular PCC) (Fig. 4B). O botão “Compile” testa o código e cria um arquivo temporário no diretório temporário Java e exibe o resultado da compilação com uma etiqueta “Succeeded” ou “Failed”. Se bem-sucedido, o código personalizado compilado é lido novamente na memória e aplicado às células selecionadas.

O resultado de cada análise é uma tabela que especifica a imagem e um número identificador para cada célula (Fig. 4C), e para cada célula, são fornecidos valores: (i) a métrica selecionada; (ii) os parâmetros físicos; e (iii) a intensidade média do sinal para cada canal (se selecionado). Nota: “NaN” na tabela de saída indica a falha no cálculo de um valor. Os usuários também podem gerar janelas de resumo (com o número de células, média, mediana e desvio padrão para a métrica selecionada) (Fig. 4D), histogramas de valores métricos (Fig. 4E), imagens de máscaras binárias e uma lista de ROIs que representam a posição e o número de cada célula em cada imagem no gerenciador de ROI. Listas de ROI e imagens de máscaras binárias podem ser salvas para re-análise das mesmas células.

Aplicações da EzColocalização

EzColocalização é projetada para ser usada de forma modular para facilitar a customização de análises para uma grande variedade de experimentos e necessidades dos pesquisadores. Esta seção concentra-se em demonstrar ferramentas específicas no EzColocalization para resolver problemas do mundo real em diversos conjuntos de imagens.

Na primeira aplicação do EzColocalization, são usadas imagens de neurônios hipocampais de rato da Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, que são atribuídas a Dieter Brandner e Ginger Withers) para demonstrar: (i) o uso de um canal repórter para identificação celular quando um experimento não tem imagens não-reportadoras separadas para identificação celular; (ii) filtros celulares para seleção de células; e (iii) ferramentas de visualização para escolha de métricas. O fluxo de trabalho da análise é descrito na Fig. 5A. Na primeira etapa, foram criadas duas pilhas de imagens de repórteres: uma pilha com imagens onde se etiqueta F-actin (usando um peptídeo falloidina conjugado com rodamina); e a segunda pilha com imagens onde se etiqueta tubulina (usando um anticorpo conjugado com Alexa 488) (Fig. 5B). A interação de F-actin e tubulina é importante para o crescimento e migração dos neurônios31,32. Utilizamos as imagens da F-actin para identificação celular porque ela está presente em todas as células e mostra os limites celulares8. As células individuais foram selecionadas a partir das imagens de F-actin aplicando um limiar para identificação de células24 e utilizando um filtro celular para remoção de detritos celulares (nota: valores dos parâmetros na Fig. 5A).

Após as células terem sido selecionadas, a intensidade dos sinais do comunicador foi examinada utilizando mapas de calor celular e scatterplots. Verificou-se que os repórteres não colocaram em níveis de sinal elevados e que havia uma relação complexa entre as intensidades de sinal (Fig. 5C,D). Devido a esta última, a localização foi quantificada usando os M1 e M2 de Manders e TOS (Supplementary Information). M1 e M2 foram avaliados nos limiares selecionados pelo método de Costes para a célula descrita na Fig. 5B, e os valores foram de 0,289 e 0,995, respectivamente. Esses valores são geralmente interpretados como indicando que a tubulina tem alta colocalização com F-actin, e F-actin tem baixa colocalização com tubulina. Os valores de TOS foram avaliados através da geração de uma matriz métrica com valores de TOS medianos. A matriz mostrou colocalização, anticolocalização e não-colocalização em diferentes limiares para as intensidades de sinal da tubulina e F-actin (Fig. 5E). Nos locais das células onde a F-actin e a tubulina têm o maior sinal de intensidade (10% do máximo de pixels para cada canal), o valor mediano da TOS é de -0,36 (n = 20). Este valor negativo indica anticolocalização, o que é consistente com a impressão obtida nos mapas de calor e scatterplots, e com outros relatórios8.

Na segunda aplicação, imagens de Saccharomyces cerevisiae submetidas a mitose foram obtidas da Cell Image Library33 para demonstração: (i) identificação celular através de esboços desenhados à mão (para experimentos onde métodos automatizados de identificação celular não podem ser aplicados); e (ii) alinhamento da imagem. As entradas do relator foram uma imagem de uma estirpe do tipo selvagem (“controle”; CIL: 13871) que tem a proteína BFA1 que carrega TEM1 no corpo do fuso, e uma imagem de uma estirpe sem a proteína BFA1 (∆bfa1 delete mutant; CIL: 13870). Nestas imagens, as células expressaram a proteína TEM1 fundida à GFP e o DNA foi rotulado com DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindole). O TEM1 localiza-se nos corpos do fuso durante a mitose e está implicado em desencadear a saída da mitose33. O fluxo de trabalho é mostrado na Fig. 6A. Nesta aplicação, os ROIs foram desenhados manualmente em torno das células usando a ferramenta de seleção “Freehand” no ImageJ em imagens DIC. As máscaras binárias, que foram usadas para selecionar áreas de células, foram criadas selecionando os ROIs e usando as funções “Clear Outside” e depois “Auto Threshold” do ImageJ24 (Fig. 6B). As áreas de células foram utilizadas para identificação das células e para corrigir o alinhamento entre as imagens DIC e os canais do repórter usando o algoritmo “Default” threshold (Fig. 6C). Seguindo esta identificação celular e alinhamento da imagem, as imagens estão agora prontas para visualização e análise como descrito no exemplo anterior.

Na terceira aplicação, imagens de Caenorhabditis elegans adultos inteiros obtidas da Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 foram utilizadas para demonstrar isso: (i) a EzColocalização pode analisar a colocalização em organismos inteiros; e (ii) os filtros “celulares” podem selecionar organismos individuais com base na intensidade do sinal do repórter. As imagens neste exemplo são do mesmo conjunto de dados utilizados em nosso estudo descrevendo TOS (mas não são as mesmas imagens)8. O fluxo de trabalho é mostrado na Fig. 7A. Os contornos de C. elegans individuais foram desenhados no ImageJ em imagens de campo brilhante para criar ROIs, e os ROIs foram adicionados ao gerenciador de ROI para identificação da “célula”. O GFP expresso pelo promotor clec-60 no intestino anterior foi o repórter 1 e o mCherry expresso pelo promotor myo-2 dentro da faringe, que é um órgão próximo ao intestino anterior35, foi o repórter 2. Os filtros celulares para parâmetros físicos eram desnecessários porque apenas os objetos considerados adequados C. elegans tinham contornos desenhados em torno deles em primeiro lugar. Entretanto, filtros celulares para intensidade de sinal eram necessários porque alguns C. elegans tinham baixo sinal de GFP, possivelmente devido ao silenciamento de transgene36,37 (Fig. 7B). A posterior visualização e análise pode ser realizada como descrito na primeira aplicação.

Na quarta aplicação, demonstramos a análise de colocalização para três canais repórteres. O fluxo de trabalho foi o mesmo que para dois canais de repórter, exceto que “3 canais de repórter” foi selecionado primeiro no menu principal “Configurações” (Fig. 8A). As imagens foram obtidas da Coleção Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Versão 1, Conjunto de imagens: 37983, imagem: p23_s9) de células cancerosas ósseas U2OS (n = 66)38. As três imagens relatadas tinham DNA, retículo endoplasmático (ER) e mitocôndria respectivamente corados com Hoechst 33342, concanavalina A/Alexa Fluor488 conjugado e MitoTracker Deep Red (linha superior, Fig. 8B). A identificação celular foi realizada com uma imagem da membrana plasmática rotulada com aglutinina de germe de trigo (WGA)/Alexa Fluor 555 conjugado (canto superior esquerdo, Fig. 8B). Nota: a imagem também tinha o aparelho Golgi e a rede F-actin etiquetada38. A membrana plasmática foi rastreada usando a ferramenta de seleção de polígonos do ImageJ para criar ROIs para as células individuais, e o gerenciador de ROI contendo os ROIs foi selecionado para identificação da célula.

Os padrões de localização foram visualizados da mesma forma que para dois repórteres, exceto por isso: (i) existem três conjuntos de mapas de calor para os repórteres ao invés de dois (linha inferior, Fig. 8B); e (ii) mapas de dispersão e matrizes métricas estão em três dimensões (Fig. 8C-F). Há a opção na aba Visualização e na aba Análise (Fig. 8G) de medir a colocalização para os três repórteres usando as métricas ICQ, TOS ou Manders’ M1, M2 e M3. Das três métricas, descobrimos que o TOS era o mais fácil de interpretar. O TOS tem um único valor para medir a colocalização de todos os três sinais dos repórteres, e mostrou claramente os sinais dos repórteres para o núcleo, mitocôndrias e ER sobrepostos em limiares baixos (ou seja, em valores altos de FT há colocalização; cor vermelha na Fig. 8E) e não se sobrepôs em limiares altos (ou seja, em valores baixos de FT há anticolocalização; cor azul na Fig. 8E). Essas observações são consistentes com o núcleo, mitocôndrias e organelas de ER que se sobrepõem em suas bordas (onde o sinal de seus repórteres é tipicamente menor) devido a interações físicas conhecidas, mas não em seus centros (onde o sinal de seus repórteres é tipicamente maior) porque são estruturas distintas em células39,40,41,