Extrato de Alho

Extrato de Alho Antigo

Uma fonte alternativa de alho que é inodoro e mais rico em antioxidantes do que bolbos de alho fresco é o AGE, um dos suplementos de alho mais conhecidos. O AGE é uma forma concentrada de alho processado que tem sido demonstrado em vários estudos científicos como seguro e eficaz em proporcionar benefícios à saúde. Os efeitos biológicos adicionais, tais como hepatoprotetores, imunossupressores, anticancerígenos e atividades quimiopreventivas atribuídas ao EMA podem ser devidos a compostos como S-allylcisteína (SAC), S-allylmercaptocisteína (SAMC), N(α)-fructosil arginina (FruArg), saponinas, e outros, formados durante o processo de extração a longo prazo. Não é necessário que os preparados de alho contenham compostos odoríferos como tiosulfinatos (por exemplo, alicina) para serem eficazes; eles se decompõem e desaparecem durante qualquer processamento. Embora os componentes transitórios semelhantes à alicina não sejam diretamente ativos, os dados disponíveis sugerem que um preparado de alho livre de alicina que é padronizado com um componente biodisponível como SAC é ativo e vários efeitos do alho podem ser atribuídos a ele (Amagase, 2006).

AGE tem diversas atividades biológicas, incluindo efeitos imunomoduladores e antioxidantes. É utilizado como componente principal de tónicos não sujeitos a receita médica e de medicamentos de prevenção do frio ou suplementos dietéticos. AGE é comercializado sob o nome comercial Kyolic pela Wakunaga Company (Japão). AGE é, como o nome sugere, produzido pelo envelhecimento do alho; o alho fresco é fatiado, macerado e mantido em etanol 15-25% à temperatura ambiente por 18-20 meses (Lawson, 1993). O meio de incubação ou extrato é então filtrado e concentrado até secar e é armazenado a -20°C para estudos futuros. Mudanças químicas ocorrem quando os extratos de alho são envelhecidos por longo tempo (Lawson e Wang, 1995). Compostos como alicina, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, são encontrados a diminuir durante o envelhecimento. AGE é mais rico em antioxidantes do que outros preparados comerciais de alho e alho fresco (Wang et al., 2015), e também aumenta os antioxidantes celulares, incluindo glutationa que ajuda a manter um sistema imunológico saudável e previne a toxicidade de drogas, e peroxidases que eliminam os peróxidos tóxicos. Os compostos OS, SAC e SAMC, que são produzidos apenas durante o processo de envelhecimento, são responsáveis pela actividade antioxidante dos AGE.

Kyo et al. (1997) examinaram o efeito dos AGE na função dos mastócitos e dos linfócitos T activados, adoptando o sistema de libertação de histamina in vitro, o sistema de reacção cutânea mediada por IgE in vivo e o sistema de reacção de fase tardia in vivo. Os resultados observados sugerem que a aplicação de AGE poderia modificar, direta ou indiretamente, a função dos mastócitos, basófilos e linfócitos T ativados que desempenham um papel importante nas reações alérgicas em cascata, incluindo inflamação.

Num estudo sobre o efeito dos AGE na produção de NO (medido como metabólitos NO nitrito e nitrato) no plasma de camundongos, os AGE (2,86 g/kg, p.o.) aumentaram temporariamente a produção de NO em 30-40% de 15 a 60 min após a administração (Morihara et al., 2002). Esses autores concluem que a EDA aumentou a produção de NO pela ativação da NO sintase constitutiva, mas não da NO sintase induzível e pode ser um suplemento útil na prevenção de doenças cardiovasculares.

AGE, extraído por mais de 10 meses, é menos irritante e menos tóxico (Lawson e Wang, 1995). Vários estudos experimentais têm demonstrado que a EDA possui propriedades antioxidantes, antistress, imunomoduladoras, cardiovasculares e hepatoprotetoras (Kasuga et al., 2001). Kyo et al. (1998) descobriram que o EDA poderia ser um modificador imune significativo, que mantém a homeostase das funções imunes, e poderia exibir atividades antitumorais através da modulação imune. Consequentemente, o AGE estimulou a proliferação de células do baço do rato e a libertação de citocinas (IL-2, TNF-α e IFN-γ), aumentou as actividades da NK, e aumentou a fagocitose por macrófagos peritoneais. O tratamento com AGE também estimulou a reatividade dos linfócitos em resposta às citocinas ou mitógenos.

No modelo de estresse psicológico, o AGE preveniu significativamente a diminuição do peso do baço e restaurou a redução dos PFCs hemolíticos anti-sépticos (SRBC) causados pelo estresse elétrico; estes resultados indicaram que o estresse psicológico prejudica qualitativa e quantitativamente a função imunológica, e que o AGE é extremamente útil para prevenir danos psicologicamente induzidos (Kyo et al., 1999). No modelo de rato alérgico mediado por IgE, o AGE diminuiu significativamente o inchaço do ouvido específico do antigénio induzido pela aplicação de cloreto de picryl no ouvido e administração i.v. de anticorpo antitrinitrofenil (Kyo et al., 2001). No modelo de células de carcinoma transplantadas, os AGE inibiram significativamente o crescimento de células Sarcoma-180 (alogênicas) e de células de carcinoma de pulmão LL/2 (syngênicas) transplantadas em camundongos. Concomitantemente, foram observados aumentos nas atividades NK e killer das células do baço em camundongos portadores de Sarcoma-180 administrados AGE.

A fim de confirmar os efeitos do AGE nos adenomas colorretais (n=51), Tanaka et al. (2004) conduziram um estudo randomizado duplo-cego usando grupos de dose alta de AGE (AGE 2,4 mL/dia) e baixa de AGE (AGE 0,16 mL/dia). O número e tamanho dos adenomas antes da ingestão (0 mês) e 6 e 12 meses após a ingestão indicaram um potencial efeito supressor sobre os adenomas colorretais. Os resultados sugerem a possibilidade de efeitos preventivos e terapêuticos dos EDA sobre os adenomas colorretais, embora seja necessário investigá-los em estudos de maior escala e de longo prazo (Tanaka et al., 2004, 2006).

Num estudo randomizado duplo-cego de pacientes (n=50) com câncer colorretal, hepático ou pancreático inoperável, os EDA foram administrados a um grupo e um placebo foi administrado a outro durante 6 meses. Embora não tenha sido observada diferença na qualidade de vida, tanto o número de células NK como a atividade das células NK aumentaram significativamente no grupo EDA (Ishikawa et al., 2006); este estudo particular mostrou que a administração de EDA a pacientes com câncer avançado do sistema digestivo melhorou a atividade das células NK. Os EDA suprimiram a proliferação de três linhas de células cancerosas colorrectais (HT29, SW480 e SW620) da mesma forma, mas as atividades invasivas de apenas células SW480 e SW620 foram inibidas pelos EDA (Matsuura et al., 2006). Estes resultados indicaram que os AGE poderiam prevenir a formação de tumores inibindo a angiogênese através da supressão da motilidade das células endoteliais, da proliferação e da formação de tubos. Matsuura et al. (2006) sugerem que os EDA seriam um bom agente quimiopreventivo para o câncer colorretal devido à sua ação antiproliferativa sobre as células do carcinoma colorretal e atividade inibitória sobre a angiogênese.

Foi estudado o efeito quimiopreventivo dos EDA sobre a carcinogênese do cólon e proliferação celular em ratos neoplásicos do cólon induzidos por 1,2-dimetil-hidrazina (DMH) (Katsuki et al., 2006). Ratos receberam injeções semanais de DMH (20 mg/kg, s.c.) por 20 semanas, e foram alimentados com uma dieta basal ou dieta contendo 4% de EDA. O soro de ratos tratados com AGE continha SAC detectável. A dieta dos AGE reduziu significativamente o número de tumores no cólon e focos criptográficos aberrantes (FAC) em comparação com a dieta basal; estes achados sugerem que os AGE têm um efeito quimiopreventivo na carcinogênese do cólon através da supressão da proliferação celular.

Foi investigado o efeito da administração de I.p. de AGE em uma inflamação alérgica estabelecida das vias aéreas em camundongos BALB/c (Zare et al., 2008). Os resultados indicaram que os EDA causaram uma diminuição significativa nos critérios de marca registrada dos níveis de inflamação alérgica das vias aéreas, que incluíam a porcentagem de eosinófilos no lavado, eosinófilos peribrônquicos pulmonares, nível de IgG1 no lavado e soro, grau de células mucosas produtoras de taças, e inflamação peribrônquica e perivascular. Zare et al. (2008) concluem que a EDA tem o potencial de atenuação das características inflamatórias da inflamação alérgica das vias aéreas em um modelo murino.

Expressão dos receptores CD36 do necrófago em macrófagos está envolvida na captação oxidada de lipoproteínas de baixa densidade e formação de células espumosas durante o desenvolvimento de lesão aterosclerótica. Morihara et al. (2010) examinaram os efeitos da EDA, que aumenta as concentrações celulares totais de tióis e glutationa, na expressão do CD36 em monócitos ou macrófagos humanos (células THP-1 e monócitos humanos primários). Seus dados indicam que o EDA inibe a expressão do CD36 através da modulação da via gama do receptor do ativador do peroxisoma proliferador (PPARgamma) em macrófagos humanos e diferenciação dos monócitos em macrófagos.

Em camundongos de Kunming portadores de carcinoma foregástrico murino, foi demonstrado que ao administrar extrato de alho preto envelhecido (ABGE) intraperitonealmente por 2 semanas, foram observados efeitos antitumorais significativos do ABGE, tais como inibição do crescimento de tumores inoculados (Wang et al.., 2012). Investigações posteriores de dismutases séricas de superóxido, glutationa peroxidase, IL-2 e o aumento dos índices de baço e timo indicaram que a ação anticancerígena da ABGE pode ser devida aos seus efeitos antioxidantes e imunomoduladores.

Em estudos recentes foi demonstrado que a administração de AGE (100 mg/kg, i.p.) resultou em melhor resposta imunológica contra tumores fibrossarcoma subcutâneos implantados WEHI-164 em ratos BALB/c (Fallah-Rostami et al.., 2013; Tabari e Ebrahimpour, 2014). Os camundongos que receberam EDA têm um tempo de sobrevivência significativamente maior em comparação com os camundongos de controle. O efeito inibitório no crescimento tumoral foi observado em camundongos tratados com AGE. A relação CD4+/CD8+ e a produção in vitro de IFN-γ de esplenócitos foram significativamente aumentadas no grupo EDA. A citotoxicidade específica WEHI-164 dos esplenócitos de camundongos tratados com AGE também foi significativamente aumentada.

Naltrexone (NTX), um antagonista dos receptores opióides, tem efeitos imunomoduladores e antitumorais. Recentemente, verificou-se que a EDA (100 mg/kg, i.p.) mostrou efeitos sinérgicos com a NTX (0,5 mg/kg, i.p.) na inibição do crescimento tumoral do fibrossarcoma WEHI-164 e incremento do tempo de sobrevida (Ebrahimpour et al., 2013). Camundongos que receberam AGE+NTX tiveram tempos de sobrevida significativamente maiores em comparação com os camundongos tratados apenas com AGE ou NTX; um efeito inibitório aumentado no crescimento tumoral foi observado no grupo de terapia combinada. A relação CD4+/CD8+ e a produção in vitro de IFN-γ de esplenócitos foi significativamente aumentada nos grupos EDA+NTX e NTX. A citotoxicidade específica de esplenócitos WEHI-164 também foi significativamente aumentada em ratos tratados com AGE+NTX.

No grupo de ratos F344 com carcinogênese induzida por DMH que receberam uma dieta basal contendo 3% p/p de AGE, houve uma diminuição no número de ACF sem qualquer alteração na patologia tumoral bruta (Jikihara et al., 2015). A EDA mostrou um menor número de lesões de adenoma e adenocarcinoma pela análise histológica; a coloração imunohistoquímica indicou que a EDA suprimiu a atividade proliferativa nas lesões de adenoma e adenocarcinoma, mas não mostrou nenhum efeito sobre a mucosa normal do cólon. Além disso, os autores demonstraram que a EDA retardou a progressão do ciclo celular regulando para baixo a expressão da ciclina B1 e cdk1 via inativação da NF-κB em células humanas de câncer colorretal, mas não induziu apoptose.

Células imunes inatas são responsáveis pelo inflammation necessário para matar patógenos; dois linfócitos inatos-γδ-T e células NK – parecem ser suscetíveis à dieta modification. Nantz et al. (2012) fizeram um estudo sobre o efeito da EDA na proliferação e ativação celular e inflammation, e se essas mudanças afetaram a ocorrência e gravidade das constipações e flu. Após 45 dias de consumo de EMA (2,56 g EMA/dia) ou suplementos de placebo, as células γδ-T e NK proliferaram melhor e foram mais ativadas que as células do grupo de placebo em participantes humanos saudáveis (n=120; 21-50 anos) durante a estação do frio e da gripe. Após 90 dias, embora o número de doenças não fosse significantly diferente, o grupo EDA mostrou redução do resfriado e flu severidade, com uma redução do número de: (1) sintomas, (2) dias de funcionamento sub-óptimo dos participantes, e (3) dias de trabalho/escola perdidos. Estes resultados sugerem que a suplementação com EDA pode melhorar a função das células imunes e pode ser parcialmente responsável pela redução da gravidade das constipações e flu relatado, talvez com menos acompanhamento inflammation (Nantz et al., 2012; Percival, 2016).

Atributos imunomoduladores de compostos de OS em extrato de alho velho (AGE)

Lee et al. (1994) mostraram que os compostos de tioalil, constituintes naturais do alho e/ou IDAE e conhecidos por inibir células malignas, também podem reduzir a proliferação de células normais. Os compostos de SO do alho inibem a ativação carcinogênica, impulsionam os processos de desintoxicação da fase 2, causam parada do ciclo celular na fase G2/M, estimulam a via apoptótica mitocondrial e aumentam a acetilação das histonas (Iciek et al., 2009). Além disso, esses pesquisadores têm apresentado outros aspectos pouco conhecidos da ação molecular dos compostos de OS, como modulação do estado redox celular, envolvimento na transdução de sinal e modificação pós-tradução de proteínas por enxofre sulfúrico ou pela formação de dissulfuretos mistos (reações de S-tiolação).

A capacidade dos compostos de SO para impedir a proliferação e viabilidade das células cancerosas está estreitamente correlacionada com o comprimento da cadeia do enxofre. Os dados disponíveis suportam um mecanismo de parada mitótica das células cancerígenas devido à alteração da rede de microtubos, provavelmente como consequência da alta reatividade dos átomos de enxofre contra os grupos de tiol de diferentes macromoléculas celulares controlando funções reguladoras cruciais (Cerella et al, 2011); esses achados indicam um potencial promissor para o uso de compostos OS de alho na quimioprevenção e quimioterapia.

ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) é um mediador chave do efluxo de colesterol para apoA-I em macrófagos carregados de lipídios, que é o primeiro passo do transporte reverso de colesterol in vivo e um passo crítico na prevenção da aterosclerose; a expressão aprimorada do ABCA1 pode inibir a formação de células de espuma e, consequentemente, reduzir o risco aterogênico. Em um estudo, foi demonstrado que o SAC pode aumentar a expressão de ABCA1 em macrófagos humanos THP-1 e pode ser benéfico na promoção do efluxo de colesterol reverso (Malekpour-Dehkordi et al., 2013).

Schäfer e Kaschula (2014) propuseram recentemente uma ligação entre a atividade imunomoduladora dos compostos de SO do alho e a prevenção do câncer. Eles levantam a hipótese de que o alho provoca respostas antiinflamatórias e antioxidantes que ajudam a preparar o organismo para a erradicação de um tumor emergente. Em um estudo recente, Yoo et al. (2014) investigaram o efeito do alho preto envelhecido (ABG) na inibição da resposta alérgica mediada por IgE em células RBL-2H3 e anafilaxia cutânea passiva in vivo. Esses autores concluem que o ABG suprime a resposta alérgica, e o mecanismo de sua ação antialérgica pode envolver supressões de Syk, fosfolipase citosólica A2 (cPLA2), 5-lipoxigenase (5-LO) e ciclooxigenase-2 (COX-2). As ações antialérgicas do ABG, extrato de acetato de etila ou uma fração ativa do ABG sugerem que eles podem ser úteis como alimentos funcionais para doenças alérgicas (Yoo et al., 2014).

Em um estudo recente, o efeito do SAC e S1PC na produção de IgA intestinal foi investigado (Suzuki et al., 2016). O S1PC aumentou a produção de IgA em linfócitos esplênicos de camundongos em cultura; entretanto, a SAC foi ineficaz. Além disso, a administração oral de S1PC em camundongos por 5 dias aumentou o nível de IgA nos líquidos de lavagem intestinal e o número de células produtoras de IgA nas manchas de Peyer. Além disso, o S1PC induziu a expressão da proteína de ligação da caixa X 1 (Xbp1) mRNA, um indutor de diferenciação plasmocítica, nas manchas de Peyer. Estes resultados sugerem que a S1PC aumenta as células produtoras de IgA através do aumento da expressão da Xbp1 mediada por Erk1/2 no intestino (Suzuki et al.., (2016).

Imunomoduladores das Proteínas na Idade

Morioka et al. (1993) relataram que a fração proteica da Idade da EDA aumentou a atividade das células NK e a citotoxicidade dos macrófagos para as células tumorais; a proliferação de linfócitos humanos mediada por IL-2 e con A também foi aumentada.

Uma investigação das mudanças ocorridas na fração proteica durante o envelhecimento do alho mostra que a proteína é gradualmente liberada no sobrenadante até um período de 4 semanas; depois disso, a concentração proteica estabiliza-se em ~2 mg/mL (Fig. 14.3, curva A). Após a reextração do alho residual após filtração e secagem ao ar, verificou-se que a proteína é novamente liberada, embora mais lentamente, e a concentração de proteína se estabiliza em ~0,5 mg/mL aos 5 meses (Figura 14.3, curva B). Na análise SDS-PAGE da EDA em vários momentos, verificou-se que apenas três proteínas principais nas regiões de 12-14 kDa foram observadas; tipicamente, ~25 mg de proteína foi obtida da EDA, começando com 100 g de alho cru (Chandrashekar e Venkatesh, 2009). Três proteínas foram separadas por cromatografia Q-Sepharose a pH 8, ou seja, QA-1, QA-2 e QA-3, todas com atividades imunomoduladoras e de ligação ao manganês; entretanto, QA-2 apresentou a maior atividade mitogênica. A identidade de QA-2 e QA-1 ImPs com os lectinas de alho ASA I e ASA II, respectivamente, foi confirmada pela atividade específica de hemaglutinação (Fig. 14.4). Embora QA-3 exiba atividade mitogênica, é desprovido de atividade de hemaglutinação, provavelmente devido à falta de uma subunidade do homodímero (Chandrashekar e Venkatesh, 2009).

Figure 14.3. Teor de proteínas do sobrenadante durante o envelhecimento ou a reextração do alho em etanol a 25% a 25°C. A proteína foi quantificada pelo ensaio de Bradford. Curva (A): Quantificação da proteína durante o envelhecimento do alho em etanol a 25% a 25°C; o eixo x é mostrado em semanas. Curva (B): Quantidade de proteína em alho residual reextraído; o eixo x deve ser notado como meses ao invés de semanas.

Figure 14.4. Fluxograma para o isolamento de frutanos de baixo peso molecular (<3 kDa; LF) e frutanos de alto peso molecular (>3,5 kDa; HF) de extrato de alho envelhecido. ASA I e ASA II denotam lectinas de alho (Allium sativum agglutinins I e II) presentes tanto no extrato de alho envelhecido (Chandrashekar e Venkatesh, 2009) quanto no alho cru (Clement et al., 2010).

Source: Reproduzido com permissão de Chandrashekar, P.M., Prashanth, K.V., Venkatesh, Y.P., 2011. Isolamento, elucidação estrutural e atividade imunomoduladora de fructans de extrato de alho envelhecido. Fitoquímica 72, 255-264. 2010 Elsevier Ltd.

Ahmadabad et al. (2011) mostraram que a proteína 14 kDa semipurificada isolada da EDA aumentou a expressão da molécula CD40 em células dendríticas (DCs) isoladas do baço de ratos BALB/c, mas não influenciou as moléculas CD86 e MHC-II. Além disso, não foram observadas diferenças significativas nos DCs pulsados com 14 kDa de proteína e DC não pulsados no teste de reação linfocitária mista alogênica (Ahmadabad et al., 2011). Daneshmandi et al. (2011) avaliaram o efeito das frações proteicas do alho sobre os macrófagos peritoneais e constataram que as frações proteicas purificadas de 14- e 47-kDa não mostram proliferação significativa de macrófagos estimulados. Tanto as frações proteicas de 14- e 47-kDa suprimiram significativamente a produção de NO a partir dos macrófagos. A citotoxicidade do sobrenadante dos macrófagos no fibrossarcoma WEHI-164 não foi afetada pelas frações proteicas de alho. Parece que tanto as frações de 14- e 47-kDa de AGE são capazes de suprimir a produção de NO de macrófagos, não mostram efeito citotóxico sobre os macrófagos e não aumentam a propriedade tumoricida dos macrófagos.

Em outro estudo, o efeito da proteína 47 kDa purificada extraída de AGE na expressão de marcadores de superfície DC foi avaliado (Hasan et al., 2012). Os 47 kDa DC tratados com proteína diminuíram a expressão de marcadores de maturação DC incluindo CD40, CD86 e MHC-II em comparação com DC não tratados, mas não foi observada diferença estatística entre os dois grupos. No tratamento das CD com 47 kDa de proteína, as CD baixaram a expressão das moléculas de superfície costimulatória e MHC-II, que é semelhante ao fenótipo tolerogênico da CD. Com base nestes resultados, Hasan et al. (2012) sugerem que a proteína de 47 kDa pode ser utilizada como um candidato potencial para gerar DCs tolerogênicas in vitro.

Imunomodulação por Fructans na EDA

A quantidade de fructans na EDA representa uma fração muito pequena (0,22%) do total de fructans no alho cru. Tanto os frutanos de alto peso molecular (>3,5 kDa; HF) quanto os de baixo peso molecular (<3 kDa; LF, oligossacarídeo com 10 unidades) foram isolados do EJA (Fig. 14.4); a análise estrutural do NMR revelou que ambos têm (2→1) ligações β-d-fructofuranosyl ligadas a uma glucose terminal na extremidade não redutora e β-d-fructofuranosyl ramificado em sua espinha dorsal (Chandrashekar et al., 2011). Tanto HF como LF apresentaram atividade mitogênica e ativação de macrófagos incluindo fagocitose; essas atividades in vitro foram comparáveis às dos conhecidos imunoestimuladores polissacarídeos, como zymosan e mannan. Esta foi a primeira evidência a mostrar que os fructans derivados de AGE possuem propriedades imunomoduladoras.

Fructans de alho isolados de AGE (denominados fructans de alho envelhecido ou AGF) produzem uma resposta humoral (IgG sérica) significativa ao OVA (30 µg; um antígeno experimental) em camundongos BALB/c administrados por via mucosa por via intranasal ou oral – uma resposta retardada surgindo no 50º dia com uma dose de 30 µg de AGF por via intranasal. No entanto, a resposta sérica de IgG foi vista mais cedo no 35º dia numa dose de 100 µg de AGF por via oral. Concentrações mais elevadas de AGF (>50 µg) foram inibitórias para a actividade adjuvante por via intranasal. Estas observações indicam que a AGF exibe atividade imunoadjuvante para um antígeno de teste embora a resposta imune humoral seja retardada (Chandrashekar e Venkatesh, 2012).

Imunomodulação exercida pela Fructosil-arginina (FruArg) em AGE

A reação amino-carbonil (Maillard) de aminoácidos com açúcares é uma reação marrom não enzimática que ocorre durante o processamento, cozimento e armazenamento dos alimentos. Produtos de reacção Maillard como o FruArg demonstraram possuir propriedades químicas e biológicas interessantes, incluindo actividade antimutagénica e antioxidante (Ide et al., 1999). Zhou et al. (2014) demonstraram que tanto o EMA quanto o FruArg podem inibir significativamente a produção de NO lipopolissacarídeo (LPS) em células microgliais de murino BV-2 ativadas por LPS; ~78% das proteínas que respondem aos tratamentos com EMA e FruArg são comuns, sugerindo que as proteínas diferentemente afetadas pelo tratamento com EMA e FruArg estão envolvidas em respostas inflamatórias e na resposta ao estresse oxidativo mediado por Nrf2. Parece que o EMA e o FruArg atenuam as respostas neuroinflamatórias e promovem resiliência nas células microgliais BV-2, suprimindo a produção de NO e regulando a expressão de múltiplos alvos protéicos associados ao estresse oxidativo.