Ensaio de permeabilidade Caco-2
Questões e respostas sobre a permeabilidade Caco-2
Please provide an overview of Cyprotex’s Caco-2 Permeability assay.
Caco-2 cells are widely used as an in vitro model for predicting human drug absorption. A linha celular de Caco-2 é derivada de um carcinoma colorretal humano, e quando cultivadas, as células se diferenciam espontaneamente em monocamadas de enterócitos polarizados.
As células são semeadas em placas de múltiplas camadas e formam uma monocamada confluente mais de 20 dias antes do experimento. No dia 20, o composto de teste é adicionado ao lado apical da membrana e o fluxo do composto através da monocamada é monitorizado durante um período de 2 horas. Para estudar o efluxo do fármaco, também é necessário investigar o transporte do composto do compartimento basolateral para o compartimento apical.
O coeficiente de permeabilidade (Papp) é calculado a partir da seguinte equação:
Onde dQ/dt é a taxa de permeabilidade do fármaco através das células, C0 é a concentração do doador no tempo zero e A é a área da monocamada celular.
Como interpreto os dados do ensaio de permeabilidade Caco-2?
Existem várias formas de utilizar os dados do ensaio de permeabilidade Caco-2. Em primeiro lugar, os compostos podem ser classificados pelos seus valores Papp. Dois compostos de referência, o atenolol (transporte paracelular passivo) e o propranolol (transporte transcelular passivo) são rastreados ao lado dos compostos de teste. Atenolol e propranolol têm absorção humana conhecida de 50% e 90% respectivamente2,3, e podem ser usados como marcadores para classificar os compostos de teste. Em segundo lugar, os dados podem ser usados em conjunto com outros parâmetros in vitro para prever a farmacocinética oral de um composto in vivo usando o software de simulação Cloe PK. Em terceiro lugar, os dados do Caco-2 podem ser utilizados para prever a permeabilidade da barreira cerebral do sangue (BBB) (Figura 3).
Correlação entre Caco-2 derivado de Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) e a taxa de permeabilidade in situ do BBB, logPS (produto de permeabilidade da área de superfície). As drogas conhecidas por permear o BBB (cafeína, imipramina, progesterona) têm logPS >-2.0 (área verde sombreada), enquanto as drogas conhecidas por não atravessar o BBB (aldosterona, hidrocortisona, cimetidina) têm um logPS ≤-3.5 (área sombreada rosa).
É mostrada uma linha de regressão que mostra uma clara correlação entre Pactive e logPS para compostos que não estão sujeitos a níveis significativos de actividade efluxante nas células Caco-2, ou seja para compostos com um Pactive de < 5 × 10 -6 cm/s. Usando esta correlação, o ensaio Caco-2 de Cyprotex pode ser usado para avaliar o potencial de BBB para compostos com Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.
Qual é a relação entre permeabilidade Caco-2 e absorção intestinal humana?
A relação entre permeabilidade Caco-2 (usando buffers de pH7,4 HBSS nos compartimentos apical e basolateral) e absorção intestinal humana é mostrada na Figura 4. Esta correlação é típica daquelas observadas na literatura para estes dois parâmetros4. É importante notar que este gráfico é influenciado pela precisão dos dados de absorção intestinal. Os valores de absorção intestinal utilizados neste gráfico são retirados de Zhao et al. 20012. Neste trabalho, a absorção intestinal humana foi extraída de várias fontes e varia consideravelmente em qualidade. Vários compostos também são conhecidos por apresentarem absorção dose-dependente (mostrado por barras de erro no gráfico).
Relação entre permeabilidade Caco-2 e % absorção intestinal humana.
Quais são as diferenças entre o ensaio de permeabilidade Caco-2 e o PAMPA?
A tela de permeabilidade Caco-2 é considerada mais representativa da absorção humana in vivo do que o PAMPA (ensaio paralelo de permeabilidade de membrana artificial). O PAMPA fornece apenas uma medida de difusão passiva, enquanto o modelo Caco-2 fornece uma melhor previsão da absorção humana para compostos que apresentam captação ativa ou efluxo ou passam através da membrana pela via paracelular. As informações de ambos os ensaios usados em conjunto podem ser valiosas na identificação da causa raiz da má absorção.
Como medir o efluxo de drogas?
Um ensaio de permeabilidade bidirecional do Caco-2 é realizado onde o transporte do composto é medido na direção apical para basolateral, bem como na direção basolateral para apical. O resultado é tipicamente relatado como uma relação efluxo i.e. Papp(B-A)/Papp(A-B). Se a taxa de efluxo for maior que dois, isso indica que está ocorrendo um efluxo de drogas. Talinolol, um substrato conhecido de P-gp, é triado como um composto de controle para confirmar que as células estão expressando proteínas funcionais do transportador de efluxo.
Como você sabe se as células formaram uma monocamada confluente?
Medição da resistência elétrica transepitalar (TEER) é usada para determinar a formação de justa-função entre as células. Além disso, o lucifer amarelo, um marcador de integridade de membrana, é co-incubado com o composto de teste no início da experiência. Se o Papp do lucifer amarelo exceder 1,0 × 10 -6 cm/s em um poço, mas o resultado do Papp derivado para o composto de teste ou composto de controle naquele poço for qualitativamente similar ao determinado no(s) poço(s) replicado(s) restante(s) (dentro do limiar do lucifer amarelo), então, baseado no julgamento científico do cientista responsável, a monocamada de células pode ser considerada aceitável. Se este não for o caso, então o resultado da monocamada afetada é excluído e um resultado n=1 é relatado, ou o composto pode ser testado novamente. Se ambas as réplicas forem afectadas, então o composto é novamente testado. Se ambos os valores de Papp amarelo lucifer falharem para o mesmo composto em duas ocasiões separadas, então é assumido que o composto exibe efeitos citotóxicos contra as células Caco-2 ou fluorescência inerente.
Como e porque é calculada a % de recuperação?
A % de recuperação pode ser útil na interpretação dos dados Caco-2. Se a recuperação for muito baixa, isto pode indicar problemas de má solubilidade, ligação do composto à placa, metabolismo pelas células Caco-2 ou acumulação do composto na monocamada celular.
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