Electroporação e Métodos de Transferência Competentes

Angelo DePalma Ph.D. Writer GEN

Por ser versátil- funciona com qualquer célula, qualquer organismo-electroporação é excepcionalmente vantajoso.

Electroporação usa um pulso eléctrico para introduzir novas espécies, geralmente moléculas polares, nas células. A técnica explora as fracas interações entre as camadas de fosfolípidos que mantêm a integridade das membranas celulares. Em uma membrana celular típica, os fosfolípidos são agrupados com seus grupos de cabeça polar apontando para fora e seus grupos de cauda hidrofóbica apontando para dentro, um arranjo que impede a passagem de moléculas polares. Sem algum tipo de assistência, as moléculas polares não podem entrar.

Quando as células experimentam um pulso elétrico controlado, a camada de fosfolípidos se abre, criando canais físicos temporários que permitem a entrada das moléculas. Sob as condições certas, os canais fecham-se rapidamente, devolvendo a célula ao seu estado original – exceto que a célula agora contém moléculas estranhas.

Além da introdução direta de genes, a eletroporação facilita a transferência direta de plasmídeos entre células ou espécies – por exemplo, de bactérias para leveduras.

Explorações extensivas continuam sobre o uso da eletroporação para a entrega de medicamentos e vacinas diretamente às células de organismos vivos. Este artigo foca aplicações não médicas.

Electroporação é mais comumente usada para transfectar células transientemente, embora a transfecção estável também seja possível. Na indústria biofarmacêutica, a transfecção transitória permite a produção de até algumas gramas de proteína para caracterização e estudos pré-clínicos. Nesta aplicação, a electroporação utilizando plasmídeos provou ser fiável e previsível. A electroporação produz de forma semelhante células transfectadas de forma estável, desde que o ADN seja introduzido de forma linearizada, tratando-o primeiro com uma enzima de restrição.

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Uma técnica entre muitas

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Electroporação está firmemente estabelecida no armamentário de técnicas de transfecção que incluem vectores virais, métodos químicos ou à base de reagentes, e fornecimento de genes mecânicos. Os vetores virais são o método mais comum para a geração de células transfectadas de forma estável para a fabricação de proteínas terapêuticas. Os vectores virais fornecem uma eficácia de transfecção muito elevada, mas são limitados em termos do comprimento do ADN inserido. Vetores virais também enfrentam problemas relacionados à biossegurança e mutagênese.

Outras técnicas mecânicas como microprecipitação, microinjeção, lipossomos, bombardeamento de partículas, sonoporação, poração induzida por laser, e transfecção de esferas são todas empregadas experimentalmente. Estas técnicas mecânicas têm um fio em comum. Elas rompem as membranas celulares e assim permitem que o DNA entre na célula. Algumas abordagens – a “arma genética”, por exemplo – envolvem a projeção de genes diretamente através da membrana para o citoplasma. Daqui, os genes podem migrar para o núcleo.

Adicionalmente, existem técnicas híbridas que exploram as capacidades dos métodos de transfecção mecânica e química. Por exemplo, inúmeros artigos surgiram na última década sobre a magnetofecção, uma metodologia de transfecção que combina a transfecção química com métodos mecânicos. Por exemplo, os lípidos catiónicos podem ser utilizados em combinação com armas genéticas ou electroporadores. A maioria da literatura sobre magnetofecção envolve a entrega de genes e moléculas terapêuticas a organismos vivos.

Electroporação tem várias vantagens: versatilidade (funciona com qualquer tipo de célula), eficiência, requisitos de DNA muito baixos, e a capacidade de operar em organismos vivos. As desvantagens incluem danos celulares potenciais e o transporte não específico de moléculas dentro e fora da célula.

Mas entre as abordagens químicas, mecânicas e de transfecção viral, a electroporação por si só fornece uma certeza razoável de sucesso independentemente da célula ou organismo alvo.

Por exemplo, a transformação química e a electroporação são dois métodos principais para introduzir ADN na Escherichia coli. Para este último, as bactérias devem primeiro ser tornadas “competentes” através da remoção de sais tampão para assegurar que a corrente atinja as células, seguido pela aplicação do pulso elétrico a 0°C para reduzir os danos aos microorganismos. A transformação química envolve a suspensão em CaCl2, que cria poros, seguida por um choque térmico que varre o DNA para as células.

Outra abordagem utiliza os lípidos catiónicos para bisbilhotar as membranas celulares abertas. A eletroporação é menos incômoda e mais eficiente, funciona em tipos celulares mais variados e se presta mais facilmente a métodos padrão do que a transfecção química. Alguns pesquisadores preferem a transformação química, entretanto, porque não requer a compra de um instrumento.

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Enabling Innovation

Embora descrita pela primeira vez em 1965, a eletroporação continua a abrir caminhos para a ciência inovadora em termos de instrumentação, protocolos e experimentos. Pelo menos uma dezena de grupos universitários desenvolveram dispositivos de electroporação baseados em sistemas microelectromecânicos (MEMS). Um dos benefícios dos dispositivos microcanelados é que eles podem ser projetados para não aplicar mais tensão do que aquela suficiente para alcançar uma incorporação razoável de macromoléculas. Essa vantagem é também uma desvantagem. Ao contrário dos sistemas de eletroporação comerciais, os chips não funcionam com todas as células.

Um grupo do Departamento de Engenharia Biomédica da Louisiana Tech University, liderado por Shengnian Wang, Ph.D., descobriu que as nanopartículas de ouro melhoram o desempenho dos equipamentos de eletroporação comerciais.1 Wang acredita que as partículas, que são altamente condutivas, reduzem a condutividade do meio celular enquanto atuam como “microeletrodos virtuais” para ajudar a abrir membranas fosfolípidas. Ele afirma um melhor desempenho (maior eficiência na entrega de DNA) e maior viabilidade celular em virtude das menores tensões de poração.

Pesquisadores da Charité Universitätsmedizin Berlin2 desenvolveram uma estratégia combinada de eletroporação de pulso quadrado para a transfecção reprodutível de células. Britta Siegmund, M.D., e colegas de trabalho suspendem as células em tampão e as submetem a um pulso inicial de alta tensão seguido por um pulso de baixa tensão de diferentes valores elétricos e temporais. A Dra. Siegmund afirma que a viabilidade é comparável à eletroporação padrão e que as eficiências de transfecção são de até 95%. Ela conclui que a técnica pode ser “facilmente adaptada para células consideradas difíceis de transferir”

Além da transferência comum de DNA, a transfecção tem sido empregada para introduzir RNA interferente em vários tipos de células. A técnica permite o estudo controlado e em pequena escala da eficiência da dosagem e do fornecimento. Problemas com a dosagem e o fornecimento de RNA têm atormentado aplicações práticas de interferência do RNA na terapia. Mas pelo menos um estudo questionou se os genes de interferência do RNA são mais efetivamente incorporados através de reagentes de transfecção ou eletroporação em células primárias.3

Kirsty Jensen, Ph.D., e colegas da Universidade de Edimburgo compararam a eficácia de 11 kits de reagentes de transfecção transitórios e eletroporação para o silenciamento do gene imunomodulador da febre mediterrânea (MEFV) em macrófagos derivados de monócitos bovinos. O grupo testou metodologias para pequena absorção de RNA interferente, derrubamento do gene alvo, toxicidade celular e indução da resposta do interferon tipo I.

Electroporação foi aproximadamente tão eficaz no derrubamento do MEFV como os reagentes de transfecção. Ao contrário dos reagentes, a eletroporação não induziu resposta de interferon, mas a viabilidade celular foi menor. Questões de viabilidade e eficiência de transfecção para electroporação são geralmente tomadas como uma avaliação do valor facial da técnica.

Dr. Jensen concluiu que “o uso de reagentes de transfecção é mais adequado do que a electroporação para o nosso trabalho de investigação do papel dos genes dos macrófagos hospedeiros na resposta à infecção”, mas que “a escolha de transfectar ou electroporar pequenos RNA interferentes em células depende dos experimentos individuais.”

Em pelo menos alguns casos onde os resultados da eletroporação são subótimos, os investigadores têm negligenciado a otimização de condições que não a força do pulso elétrico. Como recentemente observado por Hu e colaboradores4 , a eficácia da eletroporação é influenciada por fatores não elétricos, como tipo de célula ou tecido e formulação de DNA.

Electroporação tornou-se um método indispensável para a biologia do desenvolvimento in vitro e in vivo. Boa parte deste trabalho ocorre em células isoladas, contribuindo para um modelo de grande interesse em terapêutica, diagnóstico, administração de medicamentos e biologia celular. A nanoporação direta de células únicas é difícil devido à incerteza inerente à viabilidade pós-poração.

Os pesquisadores da Northwestern University desenvolveram uma técnica de célula única que proporciona alta viabilidade e eficiência.5 Sua abordagem utiliza um dispositivo de cantilever microfabricado, a sonda nanofonte (NFP). Ela fornece moléculas às células com mais suavidade do que microinjeção ou nanoporação a granel. Os investigadores têm demonstrado a eletroporação mediada por NFP de células únicas de HeLa com uma eficiência de transfecção superior a 95%, uma viabilidade de 92% e controle qualitativo da dosagem.

NFPs representam uma melhoria em relação às tecnologias de transfecção mais antigas empregando sondas de microscópio de força atômica. Técnicas baseadas em microscopia de força atômica frequentemente causam a perda de fixação ou ruptura das células. O PFN inflige menos danos às células.