Diferenciação genômica e estrutura intercontinental da população de vetores mosquitos Culex pipiens pipiens e Culex pipiens molestus

Independente origem monofilética de Culex pipiens pipiens e Culex pipiens molestus

Duas hipóteses alternativas foram propostas para explicar as diferenças nas estratégias ecológicas e fisiológicas de Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus19. Uma hipótese explica tal diferenciação como uma rápida mudança nos traços fisiológicos e comportamentais como uma adaptação a um ambiente subterrâneo que está associado às atividades humanas22. Neste cenário, as populações locais de Cx. p. molestus devem estar intimamente relacionadas às populações locais de Cx. p. pipiens30. Este cenário considera a Cx. p. molestus como uma variante ecofisiológica da Cx. p. pipiens. Uma hipótese alternativa sugere que a diferença entre Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus é o resultado da distinção em sua história evolutiva. Estratégias ecológicas e fisiológicas de Cx. p. molestus poderiam ter surgido primeiro sob o clima quente19. Mais tarde, tal estratégia pareceu relevante devido às atividades humanas que criaram um ambiente subterrâneo e, portanto, espalharam Cx. p. molestus por todo o mundo. Este cenário considera Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens como entidades evolutivas separadas.

Em nosso estudo, testamos estas hipóteses usando a análise do genoma inteiro de 40 amostras de Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens coletadas em quatro locais na Eurásia e América do Norte. Nossos achados rejeitaram a hipótese de reemergência de Cx. p. molestus das populações locais de Cx. p. pipiens e apoiaram fortemente a idéia de uma origem monofilética independente tanto de Cx. p. pipiens quanto de Cx. p. molestus de diferentes continentes. NJ e ML analisam separadamente os grupos Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus da República da Bielorrússia, República do Quirguistão, e Chicago, IL, EUA (Fig. 2, Figs. 1-3 Suplementares). A presença de um aglomerado híbrido adicional formado por espécimes autogênicos e de campo anutênico coletados de Washington, D.C., EUA, reflete mais provavelmente a existência de uma zona híbrida Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus nesta área16. No entanto, com base nas distâncias genéticas, este agrupamento está muito mais relacionado com a Cx. p. pipiens e não com a Cx. p. molestus da Eurásia e dos EUA (Chicago, IL). Adicionalmente, as análises PCA (Fig. 3) e ADMIXTURE (Fig. 4) identificaram dois clusters genéticos distintos que correspondem a Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus. Em ambos os casos, todos os espécimes de Washington, D.C. agruparam-se juntamente com Cx. p. pipiens de outros locais. Os valores de Fst em todo o par de genomas foram altamente significativos para todas as comparações (Fig. 5). Não identificamos nenhuma região específica de alta divergência no genoma (Fig. 6). Em geral, os valores de Fst foram muito mais altos entre Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens do que entre amostras autógenas e anautogênicas de Cx. p. pipiens de Washington, D.C. O grupo mais divergente, baseado em todas as análises conduzidas, foi a cepa de Cx. p. molestus de Chicago, IL, o que pode ser explicado pela muito baixa diversidade genética desta linhagem causada pela sua colonização de longa data e possível gargalo, que acelerou a deriva genética (Fig. 7).

Observações semelhantes sobre a origem monofilética independente de Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens foram obtidas usando análise por microsatélite em ~600 amostras de mosquitos Cx. pipiens derivados de diferentes locais do mundo19. O procedimento das árvores de Cx. p. pipiens, que não estão enraizadas, agrupou populações de Cx. p. pipiens acima do solo e populações subterrâneas de Cx. p. molestus do norte e do sul da Europa separadamente. Similar ao nosso estudo, as populações acima do solo de Cx. p. pipiens dos EUA formaram um aglomerado adicional sugerindo uma hibridação mais intensa entre os membros do complexo Cx. pipiens na América do Norte. A análise da mistura indicou a presença de três grandes grupos que correspondiam a Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens e Cx. quinquefasciatus. Este último aglomerado foi encontrado neste estudo apenas nas amostras dos EUA. Outro trabalho baseado em análises de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP) comparou amostras do sul e norte da Europa e cepas de Chicago, IL, EUA24. As populações norte-americanas e europeias utilizadas neste estudo mostraram um padrão semelhante de ADMIXTURE no exame do genoma AFLP. A análise dos genes COI também indicou uma origem monofilética de Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus na Europa, Ásia e África26,

Assim, a origem monofilética independente e o alto nível de divergência genética entre Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens sugerem que estes dois membros do Cx. pipiens representam entidades filogenéticas distintas com histórias evolutivas independentes antes da translocação mediada pelo homem.

Conceitos de especiação e evolução do complexo Culex pipiens

Modelos teóricos de especiação em animais poderiam ser subdivididos em dois grandes grupos: especiação alopátrica ou geográfica e especiação simpátrica ou ecológica. O primeiro conceito de especiação, que foi intensamente promovido por E. Mayr3, sugere que os táxons incipientes primeiro se tornam isolados geograficamente. Esta situação reduz o fluxo gênico entre as populações e pode levar ao acúmulo de mutações que causam incompatibilidade genética entre os híbridos. Um conceito alternativo de especiação enfatiza as barreiras ecológicas entre os táxons emergentes como principais motores de evolução31. Este cenário considera o desenvolvimento do isolamento reprodutivo entre as populações como resultado da adaptação a diferentes ambientes sem isolamento geográfico, o que geralmente ocorre diante do fluxo gênico. Nesta situação, os híbridos entre taxa incipientes tornam-se menos adequados ao ambiente que promove a seleção natural de quaisquer traços que reduzam o acasalamento entre eles. Pensamos que a diversificação geral da subespécie Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus representa um exemplo marcante de especiação através de mecanismos de isolamento por meio da ecologia. No nosso estudo, a análise Fst determinou níveis significativos de divergência genómica entre Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus (Figs. 5 e 6) em todo o genoma sem ilhas claras de especiação. Surpreendentemente, os níveis de diferenciação foram menores em torno dos centrómeros, provavelmente devido ao baixo número de SNV fiáveis nestas regiões altamente repetitivas. A diferenciação foi extremamente alta entre as estirpes de Chicago, IL, EUA de Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus, mas foi mais baixa entre as subespécies nas coleções de mosquitos da Eurásia. No geral, estas observações sugerem uma restrição significativa do fluxo gênico entre as subespécies.

Several mechanisms of reproductive isolation between Cx. p. pipiens and Cx. p. molestus have been described17. Dois deles são de ação pré-zigótica, antes da fertilização, e reduzem as oportunidades de acasalamento de mosquitos. O primeiro mecanismo está relacionado com a especialização do habitat das larvas: Cx. p. molestus ocupa porões ou outros ambientes subterrâneos, mas Cx. p. pipiens prefere corpos de água abertos acima do solo para locais de reprodução. Isto reduz as hipóteses das duas subespécies se encontrarem e acasalarem na fase adulta. O segundo mecanismo de isolamento baseia-se nas diferenças de comportamento de acasalamento entre Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens. Os machos Cx. p. molestus geralmente formam enxames homogêneos perto do solo e requerem espaço limitado para o acasalamento17. Em contraste, Cx. p. pipiens machos formam enxames próximos à folhagem cerca de 2-3 m acima do solo. Estudos experimentais do comportamento de acasalamento em gaiolas pequenas indicaram que em cruzamentos de fêmeas e machos de Cx. p. molestus o sucesso da cópula foi de 90%, mas em Cx. p. pipiens foi de apenas 3,3%32. Nos cruzamentos entre as subespécies de Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens, o sucesso da cópula também foi baixo e variou entre 6,6% a 10%, dependendo dos sexos da subespécie. Este estudo demonstrou que as fêmeas de ambas as subespécies evitam ativamente a cópula com machos de uma subespécie alternativa. Além disso, as fêmeas de Cx. p. pipiens não tiveram sucesso no recebimento de esperma de Cx. p. molestus e, como resultado, não produziram óvulos.

Dois outros mecanismos de isolamento reprodutivo descritos para Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus são pós-zigóticos, agem após o acasalamento e resultam em diminuição da aptidão dos híbridos. Um dos mecanismos está relacionado à herança de diapausa nos híbridos de Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens como traço recessivo8. Os híbridos F1 e uma parte significativa dos híbridos F2 são incapazes de desenvolver a diapausa e não conseguem sobreviver em condições de Inverno. Este mecanismo, talvez, possa explicar os níveis mais elevados de introgressão em Cx. p. pipiens em locais do sul19,23,24. Finalmente, os membros do complexo Cx. pipiens são expostos à incompatibilidade citoplasmática dos híbridos infectados com diferentes linhagens do parasita rickettsial Wolbachia pipientis. Apesar da introgressão citoplasmática deste parasita através da hibridação entre os membros do complexo Cx. pipiens33, a incompatibilidade citoplasmática poderia limitar significativamente as taxas de sobrevivência dos híbridos. Por exemplo, a infecção por W. pipientis reduziu significativamente a hibridização entre Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus na África do Sul34. Outro estudo demonstrou que, nas populações eurasianas, Cx. p. molestus só foi infectada por uma cepa de W. pipientis, mas Cx. p. pipiens por duas cepas diferentes35. Além disso, os espécimes de Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens, que utilizámos no nosso estudo, foram infectados pelas mesmas estirpes de W. pipientis no sul da República do Quirguistão, mas por diferentes estirpes no norte da República da Bielorrússia. Assim, isso pode explicar as diferenças na introgressão de Cx. p. molestus para Cx. p. pipiens que foi mais pronunciada na República da Bielorrússia do que na República do Quirguistão. Na verdade, um exemplo interessante de especiação infecciosa foi descrito no complexo sul-americano Drosophila paulistorum. Neste complexo, seis semi-espécies com distribuição geográfica sobreposta se tornaram reprodutivamente isoladas como resultado do isolamento pré e pós-infecção provocado pela infecção de Wolbachiae36,

Estudos genômicos recentes conduzidos em diferentes organismos, incluindo Drosophila simulans37, Rhagoletis mosca-das-frutas38,39, e Heliconius borboletas40,41 fornecem evidências adicionais de que a especiação ecológica ocorre na natureza. Os padrões genômicos de especiação podem ser muito diferentes2 variando de pequenas ilhas genômicas de especiação40 até níveis significativos de divergência em todo o genoma. Uma divergência genômica generalizada foi identificada entre as espécies incipientes Anopheles gambiae e An. coluzzii no complexo An. gambiae42. Estas espécies foram originalmente identificadas por diferenças na estrutura de seu DNA ribossômico como formas S e M43, mas mais tarde seu status taxonômico foi elevado ao nível da espécie44. Acredita-se que An. gambiae e An. coluzzii desenvolvam barreiras reprodutivas em simpatia como resultado das diferenças em suas preferências ecológicas45. A fase larvar de An. gambiae está associada a pequenas piscinas pluviais. Em contraste, An. coluzzi explora reservatórios de água persistentes associados ao cultivo de arroz. Embora as barreiras de pré-matação entre as espécies sejam incompletas46 , elas desenvolveram diferenças em seu comportamento de enxameação47,48 e tipos de canto divergentes49,

Assim, um alto nível de divergência genómica, uma diferença marcante na adaptação a ambientes ecológicos distintos e evidências de barreiras pré-zigóticas e pós-zigóticas para o acasalamento sugerem que Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus representam unidades ecológicas distintas que sofrem uma incipiente especiação ecológica.

Hibridação no complexo Culex pipiens

A observação mais intrigante dos membros do complexo Cx. pipiens é que, apesar das diferenças na ecologia, fisiologia, comportamento e distribuição geográfica, eles ainda podem hibridizar e produzir progênie viável na natureza, indicando que o isolamento reprodutivo entre eles não é completo. Nosso estudo também demonstrou eventos significativos de hibridização entre a subespécie Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens. A comparação do genoma inteiro indicou que a maioria das amostras de Cx. p. pipiens representam indivíduos com algum nível de introgressão de Cx. p. molestus (Fig. 4). Observamos alta discrepância entre as filogenias nuclear e mitocondrial (Figs. 2, 8), o que indica que, historicamente, a transmissão dos genomas mitocondriais pode ocorrer entre as subespécies. Ao mesmo tempo, não observamos haplogrupos compartilhados entre as populações locais da subespécie. Nos continentes, todas as filogenias mitocondriais eram fortemente monofiléticas, o que aponta para a dispersão e hibridização macho-mediterrânica. A mistura com Cx. p. molestus foi maior nas populações do sul de Cx. p. pipiens na República do Quirguistão e em Washington, D.C., EUA, mas menor nas populações do norte na República da Bielorrússia e Chicago, IL, EUA. Isto pode estar relacionado com uma incapacidade dos híbridos de desenvolver diapausa em climas frios. Para comparação, a análise por microsatélite revelou um nível modesto de hibridação entre Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus de ~8% nas cidades do norte dos EUA (Chicago, IL e Nova Iorque, NY)30,50. No sul da Europa, onde Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus puderam ser encontrados acima do solo, os níveis de hibridação entre ambos foram semelhantes e foram estimados em 8-10%51. Níveis muito mais elevados de hibridação foram encontrados em populações do sul no leste dos EUA, onde ~40% de todas as amostras foram identificadas como híbridos entre Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens19. Assim, as taxas globais de hibridação entre os membros da Cx. pipiens foram mais altas na América do Norte do que no Velho Mundo. Para comparação, a hibridação entre espécies crípticas no complexo An. gambiae (An. gambiae e An. coluzzi) variou significativamente entre 1% no Mali46 a >20% na Guiné Bissau52, o que é comparável aos níveis globais de hibridação entre Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens.

Intrigualmente, em nosso estudo, não determinamos uma assinatura de mistura de Cx. p. pipiens em nenhuma amostra de Cx. p. molestus da República da Bielorrússia, República do Quirguistão, e Chicago, IL, EUA (Fig. 4). Estes achados demonstram um fluxo muito limitado ou nenhum fluxo de genes de Cx. p. pipiens para Cx. p. molestus. Achados similares de introgressão assimétrica de Cx. p. molestus para Cx. p. pipiens foram mostrados por estudos anteriores20,51. O mecanismo da introgressão assimétrica é atualmente desconhecido. Uma hipótese sugere que os machos de Cx. p. molestus, que podem acasalar em espaços confinados, podem hibridizar com Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens fêmeas. Em contraste, a Cx. p. Os machos pipiens, que requerem espaço para a enxameação, têm uma maior disposição para acasalar com as fêmeas Cx. p. pipiens51. Entretanto, mais estudos populacionais genéticos e experimentais são necessários para explicar este fenômeno.

Finalmente, nosso estudo demonstrou que a Cx. p. pipiens pode desenvolver autogênese como resultado da introgressão adaptativa do material genético de Cx. p. molestus. No campo coletamos amostras de ambientes acima do solo e subterrâneos em Washington, D.C., EUA, nós selecionamos mosquitos para autogênese. Os mosquitos subterrâneos eram autógenos, mas os acima do solo eram anutógenos. No entanto, os mosquitos de ambas as colônias, autógena e anautogênica, formaram um único aglomerado quando se aplicou a análise de junção de vizinhos (Fig. 2). Além disso, PCA (Fig. 3) e ADMIXTURE (Fig. 4) abordam o agrupamento destas amostras juntamente com Cx. p. pipiens de outros locais. Populações com características mistas foram encontradas na Europa51 e nos EUA53. Em Portugal, um padrão incomum de comportamento alimentar com sangue em aves também foi encontrado em Cx. p. molestus54.

Thus, a presença de hibridação em curso entre membros do complexo Cx. pipiens sugere que o processo de especiação entre eles não está completo e as barreiras pós-zigóticas de isolamento reprodutivo não estão totalmente formadas. Em geral, acreditamos que os membros do complexo Cx. pipiens representam um modelo notável para o estudo de diferentes aspectos da especiação geográfica e ecológica em face do fluxo gênico contínuo entre eles e das adaptações locais a diversos ambientes.