Derivatização química em bioanálise

Aplicações

A derivatização química tem provado ser uma técnica analítica em bioanálise para superar problemas associados com baixa eficiência de ionização, instabilidade composta, baixa seletividade ou desempenho cromatográfico inaceitável (má retenção, má forma de pico e problemas de transporte) e até mesmo baixa volatilidade para a separação de GC . Esta técnica é uma ferramenta poderosa em muitas áreas da química, incluindo medicina, medicina forense, ciência alimentar, controle de doping e disciplinas ambientais. O objetivo da derivatização química é modificar a estrutura do analito (seja um nucleófilo ou eletrofilo) usando um reagente químico (seja um eletrofilo ou um nucleófilo dependendo da natureza do analito) e, como resultado, forma-se um novo composto (o derivado da reação) com propriedades químicas e físicas melhoradas para análise. As condições de reação (quantidade do reagente, tempo e temperatura de reação, etc.) são otimizadas em favor da formação do derivado desejado com o maior rendimento de reação possível. Procedimentos adicionais de limpeza da amostra podem ser desenvolvidos para eliminar subprodutos indesejados e excesso de reagentes, minimizando assim as inferências da análise.

Usando a derivatização química, a análise do impossível torna-se possível. Muitos exemplos disso têm sido apresentados na literatura; impactando a detecção de GC, LC-MS/MS e NMR. O mais notável tem sido a separação cromatográfica dos enantiômeros através da derivatização quiral utilizando reagentes de resolução específicos sem o uso de colunas quirais especializadas e condições de separação .

Considerações

A seleção do reagente químico apropriado é essencial para uma derivatização bem sucedida e depende da aplicação específica. Em geral, se o analito alvo for um nucleófilo (composto com um excesso de elétrons), um eletrofilo (composto com deficiência geral de elétrons) é selecionado como reagente, e vice-versa. Os reagentes precisam ser seletivos (alvo de um local específico da molécula), evitando assim a derivatização em múltiplos locais na molécula alvo, metabólitos ou componentes endógenos. Como exemplo, para uma molécula que contenha tanto grupos hidroxil como amino funcionais, o uso de cloretos ácidos ou anidridos como reagentes de derivação deve ser evitado, uma vez que estes irão derivar ambos os grupos funcionais. Pelo contrário, o uso de cloreto de dansyl como reagente de derivitização é apropriado para grupos funcionais de amino e fenol, uma vez que não reage com álcoois alifáticos. Outros requisitos a serem considerados na seleção do reagente incluem disponibilidade (comercialmente), pureza e custo. Tipicamente, o custo dos reagentes é mínimo, e portanto não representa uma barreira para o uso.

Usando condições otimizadas, os procedimentos de derivatização química são tipicamente robustos o suficiente para serem aplicados na bioanálise farmacêutica, e são capazes de atender às expectativas regulatórias. Isto é normalmente demonstrado durante um rigoroso processo de validação onde vários parâmetros, incluindo, mas não limitados a, precisão, selectividade, efeito matriz, etc. A selecção do padrão interno é essencial para corrigir qualquer possível perda do analito durante as várias etapas do manuseamento da amostra e da bioanálise; garantindo assim a robustez do ensaio. Quando possível, deve ser utilizado um deutério ou um padrão interno estável 13C, caso contrário, um análogo com reactividade, recuperação e propriedades cromatográficas semelhantes poderia ser substituído. Também é imperativo considerar e avaliar, quando possível, as vias metabólicas do analito de interesse; a conversão dos metabolitos de volta à molécula mãe precisa ser evitada durante o procedimento de derivatização, pois esses processos muitas vezes envolvem condições severas (pH, calor, longos tempos de incubação, etc.). Infelizmente, isto pode ser complicado pela falta de padrões de referência para os metabólitos e pela falta de informação metabólica no início do ciclo de vida do desenvolvimento da droga devido a estratégias de desenvolvimento diferencial ou acelerado.

Derivação química como forma de arte

O uso da derivação química tem diminuído nos últimos anos à medida que novas tecnologias de separação têm evoluído e se tornado mais comuns. A evolução da cromatografia de fluidos supercríticos (SFC), por exemplo, abriu um novo caminho para a análise estereoisomérica quiral; reduzindo assim a necessidade de derivação quiral em certos casos . Gerações mais sensíveis de instrumentação espectroscópica de massa quadripolar com tecnologias inovadoras ou melhoradas de ionização estão empurrando os limites de detecção para níveis baixos de picograma, e como resultado, a demanda por derivação química para melhorar a sensibilidade do ensaio (através de melhor ionização ou seletividade) diminuiu. Outras tecnologias incluindo UHPLC; micro/nano-LC (para melhor eficiência de ionização); instrumentos TOF com capacidade de mobilidade iônica (separação eletrônica, ao invés de química/física) também contribuíram para o declínio da derivação química no laboratório bioanalítico. Com isso, no entanto, a técnica ainda é aplicada para separações muito complexas, onde as tecnologias acima mencionadas não podem ter um impacto adequado. Por vezes, a derivação química associada a uma destas tecnologias tem um impacto intensificado/aditivo. Em particular, a combinação de SFC com derivatização quiral mostrou ser superior para a separação quiral em comparação com aquela análise de SFC (dados não mostrados).

Devido a este declínio da técnica e sua complexidade em comparação com outras técnicas analíticas, a derivatização química evoluiu para uma ‘forma de arte’ especial no laboratório, exigindo habilidades especializadas combinadas com uma forte proficiência química. Como consequência, menos cientistas em ambientes DMPK conseguem dominar a técnica e tornar-se proficientes na sua aplicação. A questão torna-se então como preservar essas habilidades e passá-las para as futuras gerações de cientistas analíticos. Edições especiais como esta, artigos de revisão, capítulos de livros, orientações contendo protocolos experimentais, espera-se que facilitem e promovam o uso da derivatização química como grande ferramenta analítica.

Outline

Esta edição temática cobre os avanços nas técnicas de derivatização existentes usadas na pesquisa bioanalítica, bem como novos métodos e abordagens inovadoras (por exemplo combinação da derivatização com microfluxo LC-MS e a idéia de novas técnicas de marcação química por Niwa et al. ).

A edição visa cobrir aspectos relacionados a:

• Métodos de derivação na bioanálise LC-MS (incluindo HPLC);

• Derivação de peptídeos para análise de terapêutica proteica;

• Reagentes de derivação quirais aplicados a amostras biológicas (ver Vashistha et al. );

• Derivatização para análise de compostos endógenos (ver “Beyond Classical Derivatization: Analyte ‘derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds’ por Barnaby et al. , ou ‘Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses’ por Marcos et al. );

• Derivatization procedures in human doping control (ver interessante revisão por Athanasiadou et al. ).

Embora seja verdade que a derivatização química seja apenas mais uma ferramenta na caixa de ferramentas bioanalíticas, ela é um ‘must have’ para um laboratório DMPK e um que continuará a ter um impacto abordando muitos desafios bioanalíticos.

Por isso, se você não gosta do seu analista, mude-o (com derivatização química que é)!