Degradação associada ao retículo anisoplasmático (ERAD)

2.1 Processo de dobramento de proteínas e reconhecimento de proteínas desdobradas

Sobre 30% do total de proteínas e todas as proteínas transmembrana da célula são sintetizadas no ER, que funciona como um portal de entrada no caminho secreto através do canal Sec61 . Como sendo translocada, a sequência de sinal hidrófobo terminal N da proteína recém-sintetizada é clivada por um complexo de peptidase . Modificações co- e pós-traducionais como a formação de ligações de dissulfeto, passos iniciais da glicosilação de N e ancoragem de glicofosfatidilinositol (GPI) ocorrem no ER.

O ambiente oxidante do ER auxilia a formação de ligações de dissulfeto, o que estabiliza a estrutura da proteína terciária e facilita a montagem da proteína. Durante o processo de dobramento, as ligações de dissulfeto são formadas através da oxidação de pares de tióis livres sobre resíduos de cisteína por isomerases de dissulfeto de proteína (PDIs). As PDIs atuam como ciclos, e após a oxidação inicial, as ligações de dissulfeto são por vezes isomerizadas por PDI e ERp57, que é uma thiol oxidoreductase, a fim de estabilizar a dobra correta da proteína . Por outro lado, a redução das ligações de dissulfeto de proteínas mal dobradas é necessária para a etapa de retrotranslocação do ERAD. De fato, o PDI permite a retrotranslocação da virüs-40 símia (SV-40) e da toxina da cólera . A ERdj5, uma ER oxidoreductase, reduz as ligações de dissulfeto e interage com o EDEM (ER-degradação que aumenta a proteína semelhante à manosidase) e também acelera a etapa de retrotranslocação da SV-40 . A ERDJ5 também regula a degradação da variante α1-antitripsina (nula de Hong Kong) .

Dobradura é auxiliada por chaperones moleculares que pastam contra o desdobramento e desdobramento. Os glícanos tipo chaperone ligam-se aos glícanos N, desempenhando um papel crucial na dobragem e degradação das proteínas. É evidente que N-glicosilação, controle de qualidade da dobra protéica e ERAD estão funcionalmente ligados. Depois de entrar no ER, uma grande maioria da cadeia de polipeptídeos recentemente sintetizada está sendo ligada à glicosilação com N. A enzima oligossacariltransferase reconhece a sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr na maior parte da molécula de proteína nascente e integra covalentemente um elevado teor de manose contendo grupos glicosilcânicos (Glc3Man9GlcNAc2) desde o dolichol localizado na membrana do ER até à proteína . Devido à meia-vida muito curta da forma triglicosilada de oligossacarídeo ligado à proteína, o processamento de glicosídeos começa imediatamente após a transferência dos grupos precursores de glicosídeos através das enzimas glucosidase. Após a clivagem de dois dos três resíduos de glicose, a proteína nascente pode interagir com lectinas de controle de qualidade como CNX e CLR. Esta interação é preservada até a clivagem dos resíduos de glicose remanescentes. Após a liberação da glicoproteína do ciclo CNX/CLR, a glicose final também é aparada criando um substrato não glicosilado. Isto compromete a interação do substrato com as lectin chaperones. Nesta fase, se a proteína for devidamente dobrada, poderá sair das ER para o seu destino final. Entretanto, se a glicoproteína ainda estiver desdobrada, ela é retida nas ER e reglucosilada pela UDP-glucose: glicoproteína glucosiltransferase e ricocheteada com CNX e CLR dando à proteína mais tempo para a dobra adequada. Ainda não se conhecem os mecanismos envolvidos no fim dos ciclos de regilcosilação/degilosilação. No entanto, é claro que, se a cadeia de polipeptídeos não conseguir atingir sua forma madura após repetidas tentativas de dobramento, os resíduos terminais de manose da cadeia de glicanos do núcleo são gradualmente removidos pelo ER α1,2-mannosidase I (ERMan1). O ERMan1 produz o isômero Man8GlcNAc2 pela remoção de um resíduo de manose do ramo médio dos N-glicanos. Com este corte, a glicoproteína torna-se mais pobre em substratos para regelcosilação e saída do ciclo CNX .

As manchas hidrofóbicas de proteínas devidamente dobradas são normalmente enterradas no interior das proteínas solúveis. No entanto, essas manchas podem ser expostas em proteínas mal dobradas. Se uma proteína tem superfícies hidrofóbicas expostas, a BiP se liga a ela para esconder essas superfícies propensas a agregação para tentativas de dobra adequadas, impedindo a agregação. No entanto, se a dobragem não for bem sucedida ou atrasada, a interação proteica de chaperone-misfolding estendida serve para um processo sofisticado onde a proteína é transferida para outras chaperones e/ou para o processo ERAD .

É bem aceito que o primeiro passo do ERAD é a seleção de proteínas desdobradas por chaperones. Já em 1999, descobriu-se que os substratos de ERAD de levedura diferiam de forma impressionante em suas necessidades para a Hsp70, BiP . A degradação de substratos solúveis como pαF e uma forma mutante da carboxipeptidase vacuolar protease Y* (CPY*) eram dependentes da BiP, enquanto a degradação das proteínas transmembrana Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p e Hmg2p ocorreram de forma independente da BiP. Em 2004, foi demonstrado que substratos com domínio citosólico como Ste6-166p foram degradados de forma independente da BiP, enquanto proteínas com defeitos luminosos exigiam BiP, sugerindo que, dependendo da topologia da lesão desdobrada (lúmen ER, membrana ER e citoplasma), os citosólicos ou chaperones luminosos funcionam no reconhecimento e direcionamento para a degradação .

É possível estudar o reconhecimento do substrato durante o ERAD usando proteínas desdobradas do modelo. É claro que a desmansuflação é necessária para a degradação das glicoproteínas desdobradas, uma vez que a inibição deste corte de manose estabiliza as glicoproteínas desdobradas nas ER . A superexpressão do ERMan1 acelera a degradação das proteínas N glicosiladas. A Man8-GlcNAc2 resultante contendo glicoproteínas após este corte torna-se um substrato para EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p in yeast)-uma lectin relacionada com manosidase-na ER. Foi ainda proposto que as glicoproteínas desdobradas interagem com o ERManI e EDEM1 para o seu ERAD, e que a interacção lectina-carboidrato é crucial para o reconhecimento do substrato do EDEM. Embora tenha sido sugerido que o ERMan1 fosse um temporizador biológico iniciador do ERAD de proteínas desdobradas, estudos recentes revelaram que as manosidases não são as únicas responsáveis pela demanossilação intensiva durante o ERAD, especialmente sob condições não-básicas. Sob condições de estresse ER (unfolded protein response active), a elevação transcripcional do EDEM1 aumenta a eficiência do ERAD, suprimindo a desregulamentação proteolítica do ERMan1 . Parece que os EDEMs também desempenham um papel importante na desmanosilação dos substratos . O EDEM1 também previne a reglicosilação e promove a retrotranslocação e degradação de alguns substratos de ERAD . Por outro lado, enquanto o domínio da homologia manosidase (MHD) do Htm1p é necessário para a ligação do substrato, o EDEM1 de mamíferos liga proteínas desdobradas independentemente do domínio MHD e, portanto, a ligação do substrato EDEM1 pode não requerer o corte da manose ou mesmo a glicosilação . Assim, além das moieties de glicoproteínas N-linked oligosaccharide, o EDEM1 pode reconhecer as lesões dobráveis das proteínas mal dobradas. Em resumo, os EDEM estão direta ou indiretamente envolvidos na desmanossilação das glicoproteínas e/ou servem como receptores que se ligam e visam as proteínas aparadas pelo homem para ERAD (Figura 1).

Truncagem de manose terminal do ramo C expõe α terminal α1,6-resíduos de manose ligados funcionando como sinal de reconhecimento para lectins ERAD como OS9 (Yos9 em levedura) e XTP3-B (Figura 2). Através de seu domínio da homologia do receptor de manose-6-fosfato (MRH), ambas as proteínas reconhecem principalmente α1,6-manose ligada j. Adicionalmente, o OS-9 também reconhece α1,6-manose ligada e e c .

Relatoseveracionais sugerem que fatores (EDEMs, OS9 e XTP3-B) necessários para o reconhecimento e direcionamento do substrato residem dentro de complexos supramoleculares e/ou interagem com importantes reguladores do ERAD . Por exemplo, o EDEM1 interage com o CNX, recebe substratos do ciclo CNX e facilita a degradação do substrato ERAD, como NHK-α1-antitripsina mutante . O EDEM1 também se associa aos componentes das máquinas de retrotranslocação do ER. Sugere-se que o EDEM1 liga proteínas desdobradas e usa seu domínio MHD para direcionar proteínas aberrantes para a glicoproteína SEL1L residente em ER da proteína Hrd1-SEL1L do complexo de ubiquitina ligase . A SEL1L decompõe vários factores de reconhecimento do substrato luminal e liga-os à Hrd1. OS9 e XTP3-B também associam com o complexo Hrd1-SEL1L, que também inclui BiP e GRP94 . Além disso, o XTP3-B é proposto para ligar o BiP ao complexo Hrd1. De acordo com uma hipótese, estes três chaperones (EDEM1, OS9 e XTP3-B) funcionam como oligómeros, onde um monómero interage com o substrato e outro com o complexo Hrd1-SEL1L . Além disso, o EDEM1 também interage com Derlins, uma proteína transmembrana, que é candidata ao translocon; além disso, o Derlin2 mostra-se como potencializador da interação do EDEM1 com um AAA-ATPase p97 citosólico, que associa a hidrólise de ATP à retrotranslocação de proteínas desdobradas .

Está claro que a etapa de reconhecimento do substrato do ERAD é um mecanismo complicado, no qual várias enzimas diferentes e chaperones com papéis distintos, mas concertados, no ERAD estão envolvidos. Além disso, dependendo dos substratos, o número e as características das proteínas envolvidas variam. Por exemplo, foram sugeridos papéis concertados do EDEM, ERdj5 e BiP na degradação de proteínas desdobradas. Após a saída do ciclo CNX-CLR, o EDEM1 aperfeiçoa ainda mais a estrutura de glicanos Man8-GlcNAc2 e ERdj5, reduzindo as ligações disulfatadas. Ao mesmo tempo, ERdj5 ativa a atividade ATPase da BiP. O BiP ligado ao ADP liga-se à proteína desdobrada e mantém-na numa forma de componente de retrotranslocação até se transferir para o complexo de retrotranslocação .

ERAD também está envolvido no controlo de qualidade das proteínas não glicosiladas, que é independente das proteínas semelhantes à lectina. A cadeia leve de imunoglobulina (Ig-K-LC), um substrato ERAD não glicosilado, é degradada de forma dependente de BiP. Okuda-Shimizu e Hendershot caracterizaram uma via ERAD para este substrato BiP não glicosilado e diferentes dinâmicas de interação protéica vistas como desempenhando um papel neste processo. Ig-K-LC tem duas ligações intramoleculares de dissulfureto, e a sua forma totalmente oxidada não tem a capacidade de passar do ER para o citoplasma. O BiP interage apenas com a forma parcialmente oxidada da Ig, impedindo a oxidação total do Ig-K-LC e facilitando assim a sua libertação das Urgências. Além disso, uma proteína transmembrana UBL com domínio transmembrana, proteína homoCys-residente da ER (HERP), tem sido implicada como um receptor para substratos não glicosilados de BiP . A HERP interage com a Derlin1, e a Ig-K-LC parcialmente oxidada é transferida da BiP para o complexo HERP-Derlin1-Hrd1 e subsequentemente direccionada para a degradação proteasomal . Além da BiP, a ERdj5 como dissulfida redutase também é indicada como importante para a ERAD de proteínas não glicosiladas . Os substratos não glicosilados capturados pelo BiP são transferidos para ERdj5 para a clivagem das ligações de bissulfureto. Em seguida, esses substratos são transferidos para a SEL1L com a ajuda da BiP para retrotranslocação . Além do BiP, ambos OS9 e XTP3-B foram implicados no ERAD de proteínas não glicosiladas .