Cromatografia de Filtração em Gel

Cromatografia de Filtração em Gel Aplicações

Cromatografia de Filtração em Gel, um tipo de cromatografia de exclusão de tamanho, pode ser usada tanto para fracionar moléculas e complexos em uma amostra em frações com uma faixa de tamanho particular, para remover todas as moléculas maiores que um tamanho particular da amostra, ou uma combinação de ambas as operações. A cromatografia de filtração em gel pode ser usada para separar compostos como pequenas moléculas, proteínas, complexos proteicos, polissacarídeos e ácidos nucléicos quando em solução aquosa. Quando um solvente orgânico é usado como fase móvel, o processo é referido como cromatografia de permeação em gel.

Cromatografia de permeação em gel também pode ser usada:

• Fracção de moléculas e complexos dentro de uma gama de tamanho pré-determinada
• Análise e determinação do tamanho
• Remoção de grandes proteínas e complexos
• Buffer exchange
• Dessalinização
• Remoção de pequenas moléculas tais como nucleótidos, primers, corantes, e contaminantes
• Avaliação da pureza da amostra
• Separação de ligação de radioisótopos não ligados

>

Meios de filtração gel para todos os usos acima estão disponíveis em colunas de fluxo gravitacional pré-embaladas, colunas de spin, colunas de cromatografia de baixa e média pressão, e resinas engarrafadas.

Mecanismo de Cromatografia de Filtração de Gel

Em uma coluna de cromatografia de filtração de gel, a fase estacionária é composta de uma matriz porosa, e a fase móvel é o tampão que flui entre os grânulos da matriz. Os grânulos têm um intervalo de tamanho de poros definido, conhecido como intervalo de fracionamento. Moléculas e complexos demasiado grandes para entrar nos poros permanecem na fase móvel e movem-se através da coluna com o fluxo do buffer. Moléculas menores e complexos que são capazes de entrar nos poros entram na fase estacionária e se movem através da coluna de filtração de gel por um caminho mais longo através dos poros das esferas.

Uma molécula ou complexo que esteja acima do intervalo de fracionamento para uma coluna de cromatografia de filtração de gel em particular se moverá através da coluna mais rapidamente do que qualquer molécula que possa entrar na fase estacionária. Portanto, qualquer constituinte da amostra que esteja acima do intervalo de fracionamento irá eluir primeiro (no volume vazio) antes de qualquer coisa que esteja no intervalo de fracionamento. O tamanho mínimo que permanecerá na fase móvel e não entrará na fase estacionária é conhecido como o limite de exclusão. Bio-Rad oferece meios de cromatografia de filtração em gel e colunas com limites de exclusão que variam em três ordens de magnitude, de 100 daltons a 100.000 daltons (100 kDa).

Moléculas e complexos que podem entrar na fase estacionária serão fracionados de acordo com seus tamanhos. Moléculas menores migrarão profundamente para os poros e serão mais retardadas do que moléculas maiores que não entram facilmente nos poros, e assim são eluídas da coluna mais rapidamente. Esta diferença na migração de poros leva ao fracionamento de componentes por tamanho com o maior eluído primeiro.

Em colunas de cromatografia de filtração de gel projetadas para dessalinização, troca de tampão, e a remoção de moléculas pequenas tais como nucleotídeos, os sais e compostos pequenos prontamente entram nos poros, são retardados, e migram mais lentamente através da coluna do que as proteínas maiores ou ácidos nucléicos. Portanto, os componentes de interesse na amostra são eluídos antes dos sais, nucleotídeos, etc. Os kits de limpeza de DNA usando este mecanismo frequentemente contêm colunas de spin de filtração de gel.

Resolução, aqui definida como a nitidez dos limites entre as frações de tamanho, é determinada pelo tamanho do grânulo e uma série de outros fatores. O tamanho menor do grânulo geralmente produz uma resolução mais alta em uma coluna de cromatografia de filtração em gel. Moléculas compactas se difundem através da fase estacionária mais rapidamente do que as moléculas lineares. A exclusão de tamanho, intervalo de fracionamento e taxa de eluição são afetados pela composição do tampão, força iônica e pH. Para o fracionamento de misturas complexas de proteínas, tempos de eluição e limites de exclusão de tamanho podem precisar ser determinados empiricamente.

Cromatografia de Filtração em Gel Meios

Um critério importante para meios de cromatografia de filtração em gel é que os meios sejam inertes e que nada na amostra ou qualquer tampão se ligue aos meios. Outra consideração é o tipo de coluna de filtração de gel que está sendo usada e se é usada em um sistema de cromatografia pressurizada ou colunas de fluxo gravitacional ou spin. Se um sistema de cromatografia pressurizada estiver sendo usado, tanto a coluna quanto o meio devem ser capazes de tolerar a pressão e o fluxo utilizados.

Os meios comumente usados para cromatografia de filtração em gel são baseados em contas de agarose ou poliacrilamida, dextrose para sistemas de gravidade ou baixa pressão, e resinas poliméricas para sistemas de média pressão. A escolha dos meios depende das propriedades dos componentes a serem separados e de outros fatores experimentais. A seguir, considerações gerais ao determinar a escolha do meio de filtração em gel para cromatografia:

• Fracção
• Limite de exclusão do tamanho
• Pressão de funcionamento
• Volume de escoamento
• Viscosidade da amostra
• Faixa de viscosidade da amostra
• Autoclavabilidade
• Tolerância para solventes orgânicos miscíveis em água; algumas amostras podem ser mais solúveis numa mistura hidro-orgânica
• Tolerância para detergentes, agentes chaotrópicos, formol, etc.
• Temperatura de funcionamento

Os tipos de amostras, a escolha do meio e a configuração do sistema de cromatografia determinarão quais os parâmetros mais importantes para uma determinada aplicação de purificação.