ChIP off the old block: Para além da imunoprecipitação de cromatina

Uma série de técnicas estão a ser construídas a partir de um método clássico de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) – para avaliar o que se liga ao ADN e onde. Técnicas emergentes diminuem o tamanho das amostras, interrogam complexos proteicos ligados ao DNA ou avaliam mais de perto os nucleotídeos envolvidos. Todas essas abordagens visam superar limitações de longa data do ChIP e ampliar as perguntas que os cientistas podem fazer sobre regulação gênica, desenvolvimento e doença.

Imunoprecipitação cromatina, uma das técnicas mais amplamente utilizadas em biologia molecular, foi inventada há mais de 30 anos e algumas coisas sobre ela mudaram, enquanto outras permaneceram as mesmas.

O protocolo básico ainda é semelhante ao desenvolvido nos anos 80, envolvendo a ligação cruzada de proteínas ao DNA com formaldeído e depois a fragmentação do DNA. Uma proteína que interage com o DNA é imunoprecipitada usando um anticorpo, as ligações cruzadas invertidas com o calor e o DNA associado analisado. Posteriormente os investigadores associaram a técnica ao sequenciamento profundo, desenvolvendo a técnica ChIP-seq para sondar as interacções proteína-ADN à escala genómica.

ChIP tem sido aproveitado para abordar como os fatores de transcrição operam, como os históricos modulam a expressão gênica, e outras questões básicas com implicações para o desenvolvimento biológico e doenças. Em Setembro, C. David Allis e Michael Grunstein ganharam o prestigioso prémio Lasker pelo seu trabalho na investigação de histonas que contou com o ChIP. E o ChIP-seq é agora uma pedra angular do projeto ENCODE (ENCiclopédia de Elementos de DNA), um esforço para mapear regiões reguladoras do genoma em vários tipos de células.

Os biólogos cromatídeos também estão desenvolvendo uma série de tecnologias spin-off ou paralelas para ir além do que o ChIP e ChIP-seq oferecem – examinar complexos de proteínas, para avaliar com mais precisão os nucleotídeos exatos a que um fator se liga, para olhar para pequenos grupos de células, e para começar, provisoriamente, a avaliar as interações proteína-ADN em nível de célula única.

Todas estas técnicas visam fazer coisas que o ChIP-seq sozinho não pode, ou faz apenas de forma lenta. E todas elas têm o mesmo objetivo básico: descobrir que moléculas estão associadas ao DNA e onde.

“Nós realmente não entendemos os princípios fundamentais pelos quais as seqüências funcionais reguladoras em nosso genoma determinam onde e quando os genes aparecem”, diz Bradley Bernstein, diretor do Programa de Epigenômica do Broad Institute em Cambridge, Massachusetts. Ele acrescenta que o ChIP é “limitado em muitos aspectos”. E por isso há estes esforços para tentar inovar novas abordagens ou adaptar a tecnologia de novas formas”

“Precisamos de encontrar formas precisas e determinísticas de avaliar directamente as interacções de uma única molécula sistematicamente em células únicas”.

Fazendo-o funcionar

“Chamar uma arte obscura é demais”, diz Nir Friedman, professor de ciências da computação e biologia na Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel. Mas, apesar de ser uma técnica comumente usada, “muito poucas pessoas são pacientes o suficiente para calibrar seus experimentos”, diz ele.

ChIP-seq experimentos geram muito barulho, observa Friedman. Formaldeído pode cruzar moléculas não envolvidas, anticorpos podem puxar para baixo proteínas não-alvo e sonicação – a maneira mais comum de quebrar o DNA – tende a quebrar o DNA que está em uma conformação aberta. Diz Friedman, “Pode ser que mais da metade do que você acaba seqüenciando ou olhando é uma ligação não específica”.

ENCODE publica directrizes para avaliar a qualidade dos anticorpos e rastrear dados sem sentido, nota Friedman. O projeto também fornece acesso a ferramentas computacionais recentes que são usadas, por exemplo, para normalizar dados para controles e para identificar “picos” ou regiões de possível ligação de DNA.

Selecionar o anticorpo certo, em particular, pode ser um desafio, observa Michael-Christopher Keogh, diretor científico da EpiCypher, uma empresa de epigenômica em Research Triangle Park, Durham, Carolina do Norte. Keogh esteve envolvido em um estudo recente mostrando que muitos anticorpos populares para a pesquisa de histônios têm mau desempenho no ChIP, por exemplo, ligando-se a epitopos fora do alvo. O estudo também propõe passos de validação além das diretrizes do ENCODE.

Alguns investigadores contornam o problema dos anticorpos através da engenharia de um epitopo tag no seu alvo, como no CETCh-seq (CRISPR epitopo tagging ChIP-seq). Uma técnica de longa data, DamID (DNA adenine methyltransferase identification), envolve fatores de engenharia para etiquetar o DNA vizinho com marcas moleculares.

Outros pesquisadores ainda estão melhorando a técnica ChIP básica, como o grupo de Alon Goren no Departamento de Medicina da Universidade da Califórnia em San Diego, que tem o ChIP-seq totalmente automatizado. Goren diz que a concentração ideal de anticorpos pode variar substancialmente entre anticorpos e tipos de células, e que alguns passos, como o reticulado inverso, são desnecessários. O Goren Lab também mostrou que os anticorpos monoclonais têm a borda sobre os anticorpos policlonais.

Mas mesmo quando totalmente otimizado, o ChIP-seq ainda é fundamentalmente limitado. Por exemplo, geralmente são necessárias 100.000 ou mais células para avaliar fatores de transcrição e 10.000 ou mais para avaliar as proteínas histone, diz Goren. E, na maioria dos casos, o método é orientado para olhar para uma proteína, um anticorpo de cada vez.

Diz Goren: “Uma vez que sejamos capazes de mudar a visão de pensar em proteínas para pensar em complexos, teremos uma compreensão muito melhor de como a biologia funciona e o que acontece na doença”.”

Conseguir lidar com complexos proteicos

Uma abordagem para examinar complexos é combinar ChIP-seq com espectrometria de massa (EM), usando métodos como RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) e ChIP-MS.

Uma desvantagem desses métodos, entretanto, é que proteínas não associadas ao DNA também podem ser puxadas para baixo por imunoprecipitação, diz David Steger, um biólogo molecular da Universidade da Pensilvânia, na Filadélfia. Em vez disso, diz Steger, “O que todo mundo está tentando desenvolver é proteômica específica do locus em um determinado intensificador”.

Uma técnica emergente para avaliar complexos ligados à cromatina é o ChIP-SICAP (isolamento seletivo de proteínas associadas à cromatina), desenvolvido pela equipe de Jeroen Krijgsveld no Centro Alemão de Pesquisa do Câncer em Heidelberg, Alemanha, e seus colegas. A técnica envolve a marcação do DNA ligado a anticorpos com biotina, que é então puxado para baixo com contas de estreptavidina ligadas à biotina antes do espectrómetro de massa.

Steger está a aplicar ChIP-SICAP para examinar proteínas ligadas a intensificadores que impulsionam a transição de células estaminais mesenquimais para adipócitos. Diz Steger, “O que estamos a tentar fazer é identificar um proteoma melhorador”.

Outras abordagens aproveitam o sistema de edição de genes envolvendo o Cas9, que reconhece RNAs orientadores direccionados a sequências específicas de ADN. Pesquisadores marcaram o Cas9 com biotina ou uma enzima que promove a rotulagem de biotina de proteínas próximas, que são analisadas pela EM. Esta abordagem também foi implantada para revelar as interações entre elementos genômicos distantes. Tais métodos podem potencialmente estender o repertório de métodos relacionados ao ChIP-seq que podem avaliar a arquitetura 3D do genoma, tais como Hi-C, ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing), e HiChIP, e métodos mais recentes como SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Estes métodos emergentes para avaliar complexos ligados ao DNA prometem aguçar a visão dos biólogos sobre a regulação gênica. Mas quando aproveitados à EM, eles enfrentam a limitação de que a EM não detecta prontamente proteínas de baixa abundância, observa Steger. Além disso, nem todas as técnicas mais recentes são acessíveis a nenhum especialista.

Empresas siderais oferecem serviços de terceirização de técnicas mais estabelecidas, como RIME ou ChIP-seq. As empresas que oferecem ChiP-seq e serviços relacionados incluem Active Motif, em Carlsbad, Califórnia; Diagenode em Liege, Bélgica e Denville, Nova Jersey; e Novogene, em Pequim. Estas e outras empresas também oferecem kits e componentes ChIP-seq, embora muitos laboratórios gerem os seus próprios reagentes. Keogh também observa que a pesquisa interna pode significar um maior controle das etapas de otimização.

Cuidado com parâmetros experimentais durante experimentos ChIP pode por si só aumentar a qualidade dos dados, diz Cigall Kadoch, cujo grupo estuda vários grandes complexos de proteínas macromoleculares no Dana-Farber Cancer Institute e na Harvard Medical School em Boston, Massachusetts.

Kadoch tem o cuidado de otimizar a concentração de formaldeído usado para ligar as proteínas entre si e o DNA, para cada tipo de anticorpo e célula. Ao escolher os anticorpos, ela observa se o epitópo é previsto para ser acessível na superfície e, portanto, passível de imunoprecipitação. E para ver a pegada de DNA de um complexo totalmente montado, ela aconselha a escolha de um anticorpo para uma proteína que é adicionada no final do processo de montagem. “Estas são as coisas que fazem ou quebram um projeto”, diz Kadoch.

Zeroing in on factor binding

Uma outra técnica que Steger usa é o ChIP-exo (ChIP exonuclease). Ele o utiliza para identificar – na resolução do par de base – onde vários fatores ligam o genoma.

Esta técnica começa com a fragmentação do DNA por sonicação. Uma exonuclease mastiga o DNA (na direção 5′-3′) até o limite de onde o DNA é ligado por formaldeído à sua proteína ligada. Esta abordagem resulta em uma “pegada” nítida de DNA para os fatores ligados, que pode ser mais exata do que os motivos inferidos gerados computacionalmente usando ChIP-seq.

“Nós sempre começamos com ChIP-seq, e à medida que nossas perguntas evoluem, passamos para ChIP-exo”, diz Steger, que usou a técnica para avaliar a ligação do receptor de glicocorticóides ao DNA. O receptor liga-se como um dímero a duas sequências de ADN curtas e contíguas. Steger foi capaz de resolver a ligação de um monômero, o que ele não foi capaz de fazer com ChIP-seq.

A equipe de Frank Pugh, professor de bioquímica e biologia molecular na Penn State University em University Park, Pensilvânia, simplificou recentemente seu método ChIP-exo e o adaptou à plataforma de seqüenciamento comumente usada no Illumina. Da mesma forma, Julia Zeitlinger, investigadora associada do Stowers Institute for Medical Research em Kansas City, Missouri, e seus colegas, publicaram uma técnica relacionada, o ChIP-nexus. Ambos os desenvolvimentos são “promissores”, diz Michael Snyder, presidente de genética e diretor do Centro de Genômica e Medicina Personalizada de Stanford, na Universidade de Stanford, na Califórnia.

Indo menor e mais fundo

Pesquisadores têm sido capazes de raspar o número de células necessárias para o ChIP-seq ajustando parâmetros experimentais, como o uso de um anticorpo de alta qualidade, diz Friedman.

Algumas técnicas, incluindo uma desenvolvida por Friedman, usam adaptadores sequenciais com código de barras, permitindo a diminuição do tamanho da amostra. E uma nova técnica chamada “ChIPmentation” reduz os passos envolvidos na criação de bibliotecas de sequenciação.

Um método a caminho de novos laboratórios é CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), desenvolvido por Steve Henikoff e seus colegas do Fred Hutchinson Cancer Research Center, em Seattle, Washington. Este método dispensa a ligação cruzada por formaldeído, bem como a tosquia de DNA com sonicação. Em vez disso, um anticorpo contra o alvo é amarrado ao micrócoco nuclease (MNase), que é ativado pelo cálcio para clivar o DNA de ambos os lados do alvo. Os fragmentos de ADN resultantes são sequenciados.

“Você obtém uma grande redução de sinal-para-ruído” em comparação com o ChIP-seq, diz John Stamatoyannopoulos, diretor do Altius Institute for Biomedical Sciences em Seattle. Isso se deve em parte ao corte limpo do DNA pelo nuclease, com baixos níveis de corte fora do local. Como resultado, CUT&RUN normalmente requer menos leituras sequenciais de ADN do que o ChIPseq – reduzindo os custos – e pode ser aplicado a números de células muito mais baixos. A equipa de Henikoff aplicou recentemente a técnica a 1.000 células para um factor de transcrição e a 100 células para uma modificação do historial. Stamatoyannopoulos diz que o método suplantou largamente o ChIPseq em seus laboratórios.

CUT&RUN também tem vantagens além do baixo número de células. Stuart Orkin, um biólogo molecular e professor da Universidade de Harvard, fala da técnica pela sua resolução “essencialmente a nível de nucleotídeos”. Com pequenos ajustes nas ferramentas computacionais, seu grupo foi capaz de diferenciar os locais de ligação estreitamente espaçados de um fator de transcrição envolvido no controle da expressão da hemoglobina fetal. Antes de obter este resultado, ele foi incapaz de imunoprecipitar o fator de transcrição com o ChIP convencional, possivelmente porque a reticulação do formaldeído escondeu os epitopos. CUT&RUN “funcionou logo de cara”, diz ele.

Henikoff’s lab adaptou a técnica para avaliar interações de DNA de longo alcance, 3D, e para realizar imunoprecipitação nos fragmentos clivados usando um segundo anticorpo. O grupo interrogou duas características moleculares sobre o mesmo complexo proteico – uma abordagem que poderia ajudar a resolver questões como quais combinações de marcas de histônio estão associadas a vários estados genéticos.

Trabalho a nível de célula única

Para muitos biólogos moleculares, incluindo pesquisadores de cromatina, a célula única é a fronteira final.

“Precisamos encontrar formas precisas e determinísticas de avaliar diretamente as interações de uma única molécula sistematicamente em células únicas”, diz Bernstein. “É um objectivo a longo prazo”. Os dados de células únicas podem potencialmente rastrear fatores que ligam o DNA à medida que as células saem do estado de células-tronco durante o desenvolvimento, ou em tumores com altos níveis de heterogeneidade celular.

As abordagens transversais estão a aproximar-se mais deste objectivo. No entanto, “Muitos dos métodos de célula única têm sensibilidade limitada”, diz Christopher Benner, um biólogo genoma da Universidade da Califórnia, San Diego. Bernstein e seus colegas, por exemplo, geraram dados ChIPseq unicelulares usando um sistema microfluídico e código de barras. De cada célula, a técnica capturou entre 500-10.000 “leituras” únicas, representando um evento de ligação ao DNA, em contraste com os milhões de leituras capturadas com populações de células.

Métodos transversais também podem produzir dados sobre as regiões ativas do genoma. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) implementa uma transposição hiperativa que se integra no genoma em regiões abertas de cromatina e introduz adaptadores de sequenciamento. ATAC-seq pode ser adaptado a células individuais e os dados sequenciais resultantes interrogados com uma variedade de abordagens computacionais. Estas abordagens podem, por exemplo, identificar seqüências promotoras – ou identificar padrões em experimentos que simultaneamente eliminam elementos de controle de DNA ou avaliam a expressão do RNA.

ATAC-seq sofre de desvantagens, tais como integração incompleta em regiões acessíveis, observa Snyder. Mas a técnica pode ser poderosa: Ela pode ser implantada para inserir e fazer imagens fluoróforos, resultando em dados de imagem sobre a organização genômica 3D antes do seqüenciamento, anota Snyder.

Snyder aponta para o trabalho de imagem em laboratórios como o de Alistair Boettiger em Stanford, que está desenvolvendo maneiras de simultaneamente imagearem elementos genéticos e transcrições nascentes de RNA com imagens de super-resolução, para avaliar quais elementos promovem ou quelificam a expressão gênica. “A imagem é o futuro”, acrescenta Stamatoyannopoulos. Outros pesquisadores observam que à medida que a sequência de nanoporos de “terceira geração” melhora, métodos do tipo ChIP serão desenvolvidos para se conectar a ela.

“Podemos precisar de formas totalmente ortogonais de fazer isso”, diz Bern-stein da análise de cromatina unicelular. Esse objetivo provavelmente será atingido com sucesso no final, diz ele, com “tecnologias que são um afastamento radical do que estamos usando agora”.

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