Burkholderia cepacia complex infection in an Adult Cystic Fibrosis unit in Madrid | Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

Introduction

Burkholderia cepacia complex (BCC) has emerged as significant pathogens in cystic fibrosis (CF) patients due to the risk of cepacia syndrome (a fatal necrotizing pneumonia with bacteremia), A multi-resistência inata do organismo aos antibióticos e a transmissibilidade de estirpes bacterianas entre pacientes por contacto social.1 O contato próximo e prolongado entre pacientes com FC e o compartilhamento de nebulizadores facilita a aquisição e transmissão de BCC.2,3 Está provado que a aquisição de bactérias BCC está associada à hospitalização e infecção cruzada por contato social CF.

A taxonomia do gênero Burkholderia passou por várias revisões importantes nas últimas décadas. Em meados dos anos 90, foi demonstrado que as cepas de “B. cepacia” pertenciam a pelo menos cinco espécies diferentes, que eram colectivamente referidas como o complexo B. cepacia.4 Outras análises taxonômicas revelaram que ainda mais espécies estavam presentes dentro do BCC e atualmente 17 espécies do complexo B. cepacia foram descritas4-7: B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis, B. vietanmiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina, B. pyrrocinia, B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B. lata e B. contaminans.8

Exceto para B. ubonensis, todas estas espécies foram isoladas da expectoração de pacientes com FC,6,7 com B. cenocepacia e B. multivorans como predominantes.9

B. cenocepacia é subdividida em 4 subtipos (IIIa, IIIb, IIIc e IIId), que são codificados por quatro alelos do gênero recA e há diferenças na freqüência e virulência das cepas. Além disso, B. cenocepacia é considerada um dos patógenos mais graves porque é freqüentemente associada com a redução da sobrevivência e maior risco de desenvolver síndrome de cepacia fatal.10 As espécies de BCC são intrinsecamente resistentes a muitos antibióticos como aminoglicosídeos e polimixina B e freqüentemente requerem terapia combinada para suprimir a infecção na CF.11

Infecções com bactérias BCC em pacientes com FC são frequentemente correlacionadas com o aumento da morbidade e mortalidade, e a resistência inata desses organismos a uma ampla gama de antibióticos complica o tratamento de pacientes infectados.12,13 Essa resistência é causada por vários mecanismos, incluindo permeabilidade limitada, alterações na estrutura lipopolissacarídeo e a presença de várias bombas de efluxo multirresíduos, beta-lactamases cromossômicas induzíveis e proteínas de ligação à penicilina alteradas. Além disso, a formação de biofilme in vitro foi descrita para múltiplas cepas do complexo B. cepacia e isso pode contribuir para sua capacidade de sobreviver no ambiente pulmonar CF, fornecendo proteção adicional contra antibióticos.14-16

O tratamento de pacientes infectados com CEC deve ser baseado preferencialmente nos resultados dos testes de suscetibilidade e freqüentemente incluir terapia combinada com dois ou três antibióticos mostrando atividade sinérgica.12,17,18Estudos de susceptibilidade in vitro em cepas de BCC mostram que as concentrações de ceftazidima, ciprofloxacina, meropenem, tetraciclinas ou altas doses de tobramicina têm uma atividade bacteriostática contra uma fração considerável dessas cepas.19-21 Consequentemente, esses antibióticos são frequentemente usados para tratar pacientes com FC infectados com BCC. Além disso, o cotrimoxazol ainda é freqüentemente usado no tratamento de infecções crônicas por CBC, embora testes de susceptibilidade desses antibióticos complementares tenham revelado uma baixa atividade contra muitas cepas de CBC.18,22

O objetivo deste estudo foi avaliar o isolado e a suscetibilidade do CEC e analisar as repercussões clínicas.

Métodos

O escarro dos pacientes com FC foi analisado para isolados finais de CEC, na Unidade de FC adulto do Hospital La Princesa, que está operando desde março de 1997. Essas amostras foram processadas no departamento de microbiologia no procedimento padrão23; utilizamos meio seletivo específico e estrias quantitativas, utilizando o procedimento convencional de diluição em série para a amostra. A expectoração foi submetida a um processo de homogeneização com N-acetilcisteína antes da cultura. Em nosso laboratório, os meios de cultura utilizados foram: ágar sangue, ágar chocolate bacitracina, ágar manitol-sal, ágar MacConkey, ágar cloranfenicol Sabouraud e meio seletivo para B. cepacia chamado BCSA (Biomèrieux). O tempo de incubação das placas foi de 3 a 5 dias a 35°C. O ágar de chocolate Bacitracin foi incubado em atmosfera de CO2.

A identificação preliminar das cepas de BCC foi realizada por MicroScan (Siemens) e Api 20 NE (Biomèrieux). Estes procedimentos foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante.24

Subsequentemente, as cepas foram remetidas ao Centro Nacional de Microbiologia (Majadahonda, Madrid) para a confirmação e determinação da espécie e genospecie. Para este estudo, foram realizados os seguintes métodos: Api 20 NE (biomerieux, Marcy l’Etoile) e Microplaca GN2 (BIOLOG, Hayward, CA) e métodos moleculares. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante.

Extracção de ADN cromossómico

Extracção de ADN foi realizada com o kit comercial QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante.

AnálisePCR

A amplificação de genes foi realizada num volume final de 25μl, usando o kit PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), e contendo 5μl de ADN extraído e 10pmol de cada primer: fD1 e rP225 para 16S rDNA, e BCR1 e BCR426 para recA. O ciclo térmico foi realizado num TaKaRa PCR Thermal Cycler v. III mod TP600 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Shiga) sob as seguintes condições para 16S rDNA: 94°C durante 5min para o primeiro ciclo, 35 ciclos de 15s a 94°C, recozimento durante 15s a 55°C, e extensão a 72°C durante 1min e 50s. As condições para a amplificação do recA foram as seguintes: 94°C durante 5min, 30 ciclos de 30s a 94°C, recozimento durante 45s a 55°C, e extensão a 72°C durante 10min.

Visualizamos 2μl de cada produto PCR por electroforese em gel de agarose com concentração de agarose ajustada a 1,5% e usando tampão TAE 1×. Foram incluídos marcadores de tamanho molecular em todos os géis: Marcador X 0,07-12,2kbp (Roche Applied Sciences, Mannheim, Alemanha) e GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemanha) para 16s rDNA e recA produtos, respectivamente.

Estrenos identificados como B. cenocepacia foram submetidos ao método PCR com iniciadores específicos para o grupo RecA-IIIA (BCRG3A1 e BCRG3A2) e RecA-IIIB (BCRG3B1 e BCRG3B2) sob condições previamente descritas.24

Ten μl de produtos PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose nas mesmas condições descritas acima.

Análise da seqüência de nucleotídeos

16s rDNA e recA produtos PCR foram sequenciados usando fD1 e rP2 e BCR1 como primers, respectivamente. As reações sequenciais foram preparadas por meio do Big Dye Terminator v 3.1 (Applied Biosystem, EUA) em um volume final de 10μl, de acordo com as instruções do fabricante, e analisadas com o sistema de eletroforese capilar do analisador genético ABI PRISM 3100 (Applied Biosystem, EUA). As sequências foram montadas usando o software SeqMan 3.61 (DNA Star, Inc, Madison, WI, EUA). A análise também envolveu o uso da ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST: www.ncbi.nlm.nih.gov) para estabelecer a identidade genética correta.

Análise PFGE

Relação das deformações foi analisada por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A preparação dos tampões, lise, lavagem celular e digestão de restrição foram realizadas conforme descrito anteriormente25,26 com pequenas diferenças. Foi utilizada a enzima de restrição XbaI (40U, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemanha). O PFGE foi realizado seguindo o protocolo descrito para Stenotrophomonas maltophilia por Valdezate et al.,27 e utilizando DRIII Chef System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, EUA) e concatemers de fago lambda (Biolabs, New England, UK) como marcador de peso molecular. As imagens foram obtidas com o software Quantity One v. 4.6.1 (BioRad). As imagens foram analisadas visualmente e os isolados foram considerados como genotípicamente indistinguíveis se tivessem um padrão de bandagem idêntico.

Antibioticusceptibilidade foi realizada por microdiluição com MicroScan e difusão em disco simultaneamente. Ambos os métodos foram considerados como pontos de ruptura CLSI.28 Para ciprofloxacina e imipenem, foram utilizados os pontos de ruptura de levofloxacina e meropenem, respectivamente. Foram estudados os seguintes antibióticos: ceftazidima, ciprofloxacina, levofloxacina, cotrimoxazol, minociclina, imipenem e meropenem.

Patientes com BCC foram estudados com as seguintes variáveis: idade (no início e atualmente), sexo, peso (no início e atualmente), mutação gênica Fibrose Cística Transmembrana Reguladora, evolução da função respiratória que foi determinada pela porcentagem de acordo com o valor teórico do volume expirado no primeiro segundo (VEF1) a partir do seu primeiro isolamento, bem como as pontuações radiológicas de Brasfield e clínicas de Shawchman no início do isolamento e corrente BCC.

Co-colonização com outros microorganismos foi avaliada.

O escore de Brasfield foi avaliado com 0-5 (de baixo para alto) de acordo com os sinais radiológicos: aprisionamento de ar, sombras lineares, lesões císticas nodulares, consolidação segmentar ou lobar e a impressão geral da gravidade. A pontuação global obtida foi subtraída para 25. O menor valor obtido correspondeu à radiologia mais grave. A radiologia torácica e seu correspondente de Brasfield foi realizada a cada ano.

Shwachman avaliou 4 itens com pontuação máxima de 25 cada: atividade geral, exame físico, crescimento e nutrição e radiografia de tórax. A pontuação ideal foi 100 e o estado dos pacientes foi classificado de acordo com a pontuação: excelente (86-100 pontos), bom (71-85 pontos), leve (56-70 pontos), moderado (40-55 pontos) ou grave (menor ou igual a 40).

Resultados

BCC foi isolado em 12 dos 70 pacientes adultos com FC (17,1%) durante 10 anos. Dois dos pacientes tiveram um transplante pulmonar, um deles morreu após o transplante e o outro, o BCC foi erradicado em 2005 antes do transplante que foi em 2011. O BCC foi erradicado em outro paciente em 2009. Esses pacientes foram estudados apenas por alguns meses, e assim a evolução clínica não foi registrada. B. cenocepacia foi isolada em 4 pacientes (33,3%), B. contaminans em 3 pacientes (25%), B. stabilis em 2 pacientes (16,7%), B. vietnamiensis em 2 pacientes (16,7%), B. cepacia em um paciente (8,3%), B. multivorans em um paciente (8,3%) e B. lata em um paciente (8,3%). Entre B. cenocepacia, o subtipo IIIa foi identificado em dois pacientes em 4 (50%), e o subtipo IIIb nos outros dois pacientes (50%). Um paciente tinha no início B. cenocepacia e depois tinha B. lata. Da mesma forma, outro paciente tinha B. stabilis e depois tinha B. contaminans. Em nosso estudo, 50% dos pacientes com CEC tinham cepas de Staphylococcus aureus (Tabela 1).

A análise da PFGE mostra que a mesma estirpe foi isolada em cada paciente CF, mas foi diferente entre os pacientes, o que certifica que não houve transmissão cruzada.

90% de BCC foram sensíveis ao meropenem, 80% ao cotrimoxazol, 60% à minociclina, 50% à ceftazidima e 40% à levofloxacina, 20% à ciprofloxacina e 10% à imipenem.

Os 50% dos pacientes com FC eram do sexo masculino e a idade média em que estes pacientes tiveram seu primeiro isolamento de BCC foi de 24,4 (DP: 7,71). Os 41,7% dos pacientes apresentaram F508del/outra mutação, 33,3% apresentaram F508del/F508 e 25% apresentaram outra/outra mutação.

No início foi calculado o escore Brasfield e Shwachman para todos os pacientes incluídos neste estudo, sendo a pontuação média de 18,6 e 82,3. Entretanto, o escore atual de Brasfield e Shwachman é realizado com pacientes colonizados. A pontuação média foi de 21,1 e 81. Apenas 1 paciente tinha diabetes e 6 pacientes eram portadores de insuficiência pancreática. A Tabela 2 mostra as características clínicas dos pacientes com FC que apresentaram BCC.

Tabela 2.

Características clínicas dos pacientes com fibrose cística.

Frequência do sexo (%)
Homem	6 (50%)
Feminino	6 (50%)
Média de idade (SD)
Infecção primária (n=12)	24.4 anos (7,71)
Corrente (n=9)	29 anos (8,04)
Média de peso (SD)
Infecção primária (n=12)	57.9kg (8,5)
Corrente (n=9)	58,7kg (8,6)
Frequência de mutação (%)
F508del/F508del (n=12)	4 (33. 3%)
F508del/outro (n=12)	5 (41.7%)
Outro/outro (n=12)	3 (25%)
Média de pontuação do campo de jogo
Infecção primária (n=12)	18.6
Corrente (n=9)	21.1
Média de pontuação de Shwachman
Infecção primária (n=12)	82.3
Corrente (n=9)	81
Frequência do Diabetes (%)
Corrente (n=9)	0 (0%)
		Insuf. pancreaty. frequência (%)
Corrente (n=9)	6 (66.6%)

Fig. 1 mostra a evolução da função pulmonar (%FEV1) dos pacientes que tiveram mais do que um isolamento de BCC.

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Fig. 1.

Evolução da função pulmonar dos pacientes crónicos com FC desde o primeiro isolamento de BCC na expectoração.

(0,1MB).

Discussão

Existem poucos estudos relacionados à evolução clínica de pacientes com uma espécie isolada de CEC, e há uma idéia geral de que a espécie B. cenocepacia está associada a maior morbidade e mortalidade em pacientes com FC.19 Portanto, não há muitos dados recentes sobre pacientes com CEC em Espanha. Um estudo no Hospital Universitário de Cruces mostra um aumento da incidência de colonização com CEC.29

É importante que a identificação das espécies de CEC seja realizada em centro especializado, pois os facultativos ajudam a supervisionar um acompanhamento próximo desses pacientes que são colonizados por essas espécies, pois eles podem evoluir adversamente.

Um estudo realizado por Van Pelt et al.30 mostra que o API 20 NE foi mais preciso que o MicroScan. 90% dos isolados foram identificados corretamente usando API 20NE versus 68% usando MicroScan. Eles sugerem o uso de placas BCSA para o isolamento inicial de B. cepacia diretamente do material clínico. A sensibilidade destes meios de crescimento pareceu ser excelente (96%); a especificidade não foi de 100%. Foi bastante impressionante constatar que para os ensaios automatizados, como o MicroScan, a precisão foi insuficiente. O principal resultado da presente análise é que a identificação molecular por PCR-RFLP é superior aos procedimentos de identificação bioquímica e microbiológica das espécies, embora seja de salientar que os resultados obtidos com API20 NE foram satisfatórios.30

Em nosso estudo, a B. cenocepacia, B. contaminans, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. multivorans, B. cepacia e B. lata foram isoladas das secreções respiratórias de 12 pacientes com FC examinados e B. cenocepacia foi a espécie mais prevalente como a maioria dos dados descritos na literatura européia de pacientes com FC.19 No entanto, esta descoberta não concorda com um estudo português (Susana Correia et cols), no qual as espécies mais frequentes foram B. cepacia 57% e B. stabilis 13%. Talvez devido ao uso de soluções salinas não estéreis intrinsecamente contaminadas por B. cepacia.19 Estas soluções contaminadas foram detectadas pelo Infarmed durante uma inspeção microbiológica de rotina.19 Em nosso estudo B. cepacia e B. stabilis foram isoladas em menor proporção como outros estudos na Europa e América.19

Em nosso estudo B. cenocepacia isolada, houve a mesma proporção entre os subtipos IIIa e IIIb de B. cenocepacia.

Um dos pacientes teve B. cenocepacia como primeiro isolamento, B. lata como segundo isolamento e depois foi erradicada. Outro paciente teve B. vietnamiensis em 2004 que foi erradicada, e o transplante pulmonar foi feito nele em 2011, e outro paciente foi isolado com B. cenocepacia subtipo IIIa em 2004, mas morreu no mesmo ano após um transplante pulmonar. Os resultados de sobrevivência do transplante pulmonar são piores em pacientes colonizados com B. cenocepacia, portanto algumas unidades de transplante contra-indicam o transplante nesse caso. Tem sido reconhecido que a B. cenocepacia carrega um prognóstico pior em comparação com a B. multivorans com sobrevivência mais curta quando combinada com controles de Pseudomonas aeruginosa.31 A síndrome de Cepacia tem sido relatada com estas duas espécies.26 A fisiopatologia exata desta síndrome é mal compreendida, e a taxa de mortalidade precisa é desconhecida, embora se pense que se aproxima de 100%.32

Nossos pacientes têm valores baixos de VEF1. Um grande número de pacientes já havia se deteriorado antes do isolamento do BCC como resultado da colonização por outros agentes patogênicos e da progressão da doença. Em pacientes clinicamente estáveis, não foram observadas alterações significativas nos valores de VEF1 e no estado nutricional. Há evidências de que a colonização pulmonar pode não ser detectada por culturas padrão durante algum tempo (até 2 anos) após a aquisição do BCC.33 Além disso, não está claro se, em casos de isolamento intermitente, há uma reinfecção por uma nova estirpe ou se há recrudescência da estirpe inicial.20 Na maioria dos casos em nosso isolamento diferente, não foi observada nenhuma substituição das cepas iniciais de CEC.

Casos foram registrados em que a mesma cepa (com o mesmo genótipo), que infectou persistentemente um paciente durante vários anos, foi erradicada pela antibioticoterapia ou não teve nenhum impacto aparente sobre o quadro clínico de outros pacientes. Não está claro porque as cepas das diferentes espécies de BCC diferem em sua persistência, epidemiologia e potencial patogênico na FC e porque as mesmas cepas podem estar associadas a evoluções clínicas muito diferentes.19 Depende de fatores inerentes a cada paciente individual, da co-colonização por outros patógenos e outros fatores ainda a serem identificados, enfatizando a importância da realização de estudos deste tipo.19

A resistência a antibióticos é considerada um importante fator de virulência dos organismos BCC.14 Embora a terapia seja geralmente guiada por testes de susceptibilidade antimicrobiana, a erradicação dos organismos BCC raramente é alcançada.21 Múltiplas hipóteses foram formuladas para explicar essa falha, incluindo concentrações inadequadas de antibióticos ou inativação do antibiótico na expectoração, deficiências nas defesas do hospedeiro em pacientes com FC, formação de biofilme, efeito “inóculo” e taxa de crescimento in vivo desses organismos.34

Elke et al. relataram em um estudo belga que meropenem, minociclina e ceftazidima foram os antibióticos mais ativos contra o isolamento de BCC e ciprofloxazina e trimetoprim/sulfametoxazol tiveram a menor atividade.35 Entretanto, nosso estudo descobriu que meropenem foi o mais ativo com 90% de suscetibilidade, seguido por trimetoprim/sulfametoxazol, minociclina e ceftazidima com 80%, 60% e 50%, respectivamente. Embora os organismos BCC sejam tipicamente resistentes aos aminoglicosídeos, altas doses de tobramicina inibiram a maioria das cepas testadas. A nebulização da tobramicina que produz altas concentrações máximas na expectoração é cada vez mais utilizada no tratamento de pacientes com FC.36-38

Consequentemente, essas concentrações mais altas devem ser levadas em consideração na avaliação da utilidade desse antibiótico.35 Vários relatos confirmam que a tobramicina nebulizada mostra grande promessa no tratamento de pacientes com FC infectados por BCC: por exemplo, Weidmann et al.39 recentemente descreveram a erradicação completa dos organismos BCC dos pulmões de pacientes com FC usando uma combinação de tobramicina nebulizada e amilorida. Além disso, uma terapia combinada com meropenem nebulizado e intravenoso e tobramicina também resultou no tratamento bem sucedido de uma paciente feminina com FC que sofria de síndrome de cepacia, embora as amostras de expectoração deste último paciente tenham permanecido positivas para B. cenocepacia.39

BCC espécies são intrinsecamente resistentes a muitos antibióticos como aminoglicosídeos e polimixina B e freqüentemente requerem terapia combinada para suprimir a infecção na FC.11 Os antibióticos polimixina, gentamicina e vancomicina são usados em altas concentrações em B. cepacia Selective Agar, um meio altamente eficaz para seu isolamento da expectoração da FC.11 Nzula et al.13 compararam a suscetibilidade antibiótica de seis espécies de BCC e concluíram que ela era altamente variável, exceto pela resistência inata à polimixina e não ligada ao status taxonômico dos isolados examinados. Efflux, a secreção das beta-lactamases cromossômicas e a impermeabilidade do envelope externo das bactérias BCC foram implicadas na resistência aos antibióticos.14

Em contraste, a base molecular da resistência aos biocidas nas bactérias BCC tem sido pouco estudada, apesar destes organismos estarem ligados a muitos casos de contaminação em desinfectantes e outras soluções anti-infecciosas.40

A missão e, portanto, o desafio colocado pela identificação das espécies de BCC para os laboratórios de microbiologia clínica de rotina são diferentes. Estirpes isoladas em meios seletivos e tentativamente identificadas como pertencentes ao BCC usando sistemas comerciais devem ser confirmadas com os testes bioquímicos clássicos descritos.41

A detecção precoce de BCC é extremamente importante tanto para o paciente com FC quanto para a comunidade de FC. Entretanto, um estudo recente5 indicou que menos da metade dos centros W.S. pesquisados empregam meios seletivos específicos “B. cepacia” ou incubam culturas por longos períodos, o que melhora o rendimento desse organismo. O uso dessas técnicas modernas de cultura não é tecnicamente exigente e deve ser o padrão esperado de cuidados em todos os centros de FC do mundo.

Neste estudo, apenas erradicamos B. cenocepacia em um paciente; outro paciente morreu imediatamente após o transplante, e nenhum dos pacientes tinha síndrome de cepacia e sofreu uma deterioração clínica importante, embora o período de observação tenha sido curto porque adquiriram BCC recentemente.

O melhor diagnóstico das infecções causadas por membros do BCC e outros organismos semelhantes à B. cepacia ajudará na interpretação dos resultados dos estudos de resultados clínicos e, ao fazê-lo, fornecerá informações cruciais sobre a patogenicidade e/ou transmissibilidade de cepas específicas envolvidas.5

Conflito de interesse

Nenhum dos autores tem qualquer conflito de interesse a declarar.