Anti-Fosfatidilserina/Protrombina Os anticorpos estão associados a resultados de gravidez adversos

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Abstract

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Objectivo. Determinar a prevalência e associação clínica de anticorpos anti-fosfadilserina/protrombina (aPS/PT) em pacientes com histórico de complicações na gravidez relevantes para a síndrome antifosfolipídica (APS). Materiais e Métodos. Duzentos e onze doentes com história de (a) três ou mais abortos consecutivos antes da 10ª semana de gestação (GT) (), (b) morte de um feto morfologicamente normal para além do 10º GT (), (c) nascimento prematuro de um neonato morfologicamente normal antes do 34º GT devido a eclâmpsia, pré-eclâmpsia e insuficiência placentária (), e (d) menos de três abortos consecutivos inexplicáveis antes do 10º GT (). Os soros foram analisados para anticoagulante lúpico (LA), anti-cardiolipina (aCL), anti–glicoproteína I (anti-GPI), e anticorpos aPS/PT. Resultados. 41/169 (24,3%) dos pacientes foram positivos para pelo menos uma medida de aPL. A maior prevalência foi encontrada para aPS/PT e aCL (13,0% e 12,4%, resp.), seguida por LA (7,7%) e anti-GPI (7,1%). 11/169 com manifestações obstétricas relacionadas à APS tinham apenas aPS/PT. 17,8% dos pacientes eram positivos para AE ou aCL e/ou anti-GPI; entretanto, ao somar os resultados da APS/PT, mais 7% dos pacientes puderam ser avaliados para APS. Conclusão. aPS/PT estão associados a abortos precoces ou tardios recorrentes e com parto prematuro, independentemente de outras aPL.

1. Introdução

Patientes com níveis elevados de anticorpos antifosfolipídicos (aPL) frequentemente experimentam complicações na gravidez compreendendo abortos espontâneos recorrentes, retardo do crescimento intra-uterino e pré-eclâmpsia, sugerindo que estes anticorpos podem influenciar o implante embrionário e induzir trombose da vasculatura uteroplacentária. Os critérios internacionais de classificação da síndrome antifosfolipídica (SAF) relacionam a ocorrência de complicações obstétricas e/ou trombose com a persistência da APL na SAF. Os critérios laboratoriais para a APS incluem lupus anticoagulantes (LA), anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos contra -glicoproteína I (anti-GPI). Acredita-se que vários outros “não-critérios” de aPL estejam associados à SAF; entretanto, a falta de evidências confirmando sua aplicabilidade diagnóstica até o momento impede sua inclusão nos critérios de classificação. Nos últimos anos, muitos estudos demonstraram a associação de anticorpos antiprotrombina com a patogênese da APS e alguns deles propuseram seu papel benéfico para o diagnóstico da APS. Estes anticorpos podem ser detectados por um ELISA visando apenas a protrombina (aPT-A) ou o complexo fosfatidilserina/protrombina (aPS/PT); contudo, estes últimos são mais frequentemente encontrados em doentes com SAF. Nosso grupo relatou um ELISA de aPS/PT interno como o método ideal para a determinação de anticorpos antiprotrombina clinicamente relevantes exibindo a maior proporção de AE em nossa população de pacientes. A relevância clínica dos anticorpos antiprotrombina foi descrita principalmente para pacientes com SAF e trombose, mas muito poucos estudos relataram sua associação com resultados adversos de gravidez. Uma revisão abrangente dos “anticorpos antiprotrombina” e “gravidez/obstetrícia/ abortos espontâneos/perda fecal” revelou 12 estudos, compreendendo 1031 pacientes e 988 controles (Tabela 1). Metade destes estudos não encontrou qualquer associação significativa entre anticorpos antiprotrombina e morbidades da gravidez. Pelo contrário, Akimoto et al. apresentaram associação forte e específica entre vários tipos de anticorpos antiprotrombina com pré-eclâmpsia grave e aborto espontâneo. Apenas o estudo de Bertolaccini et al. diferenciou entre diferentes complicações obstétricas e mostrou uma associação significativa de aPS/PT e aPT-A com morte inexplicável de um feto morfologicamente normal após a 10ª semana de gestação. A importância clínica dos anticorpos antiprotrombina em pacientes com resultado adverso na gravidez foi posteriormente confirmada também por Marozio et al. , que investigaram aPT-A, e Vlagea et al. que investigaram aPS/PT. Além disso, nosso grupo relatou recentemente que o aPS/PT é o fator de risco independente mais forte para complicações obstétricas em comparação à AE, aCL e anti-GPI. Entretanto, até o momento, não foram encontrados relatos descrevendo associação de anticorpos antiprotrombina com abortos consecutivos inexplicáveis no primeiro trimestre de gravidez.

Por isso, o presente estudo visa investigar a associação da aPS/PT com um histórico de complicações idiopáticas específicas da gravidez num grupo maior de pacientes e determinar se a presença de aPS/PT está associada a um risco aumentado de manifestações obstétricas relevantes para a APS.

2. Materiais e Métodos

2.1. Sujeitos

Este estudo incluiu 402 soros de amostras que foram coletados prospectivamente de 211 pacientes consecutivas do sexo feminino (mediana de idade 33 anos, IQR: 7 anos) encaminhados entre 2005 e 2013 para nossa clínica devido a possível SAAF obstétrica (Tabela 2). Entre elas, 169 tinham manifestações obstétricas incluídas nos critérios de classificação da SAF. Especificamente, 64 pacientes tiveram três ou mais abortos espontâneos consecutivos não explicados antes da 10ª semana de gestação (GT), 72 pacientes tiveram morte não explicada de um feto morfologicamente normal depois do 10º GT e 33 pacientes deram à luz prematura um neonato morfologicamente normal antes do 34º GT devido a eclâmpsia, pré-eclâmpsia ou insuficiência placentária. Entre 33 partos prematuros, 10 casos sofreram morte fetal como resultado de abrupções da placenta ou retardamento do crescimento, sendo excluídas quaisquer anomalias morfológicas. Houve 16 casos com partos induzidos devido a pré-eclâmpsia ou eclâmpsia e 7 partos pré-termo espontâneos. Os restantes 42 doentes sofreram menos de três abortos antes do 10º GT e não cumpriram os critérios de classificação da SAF.

Todos os pacientes e seus parceiros foram investigados por anormalidades genéticas. A maioria dos pacientes tinha recebido os resultados da análise genética no momento de sua visita à nossa clínica e os pacientes com anormalidades confirmadas foram excluídos do estudo.

Como grupo de controlo incluímos 87 mulheres dadoras de sangue saudáveis (idade média 42 anos, IQR: 18 anos) sem história de doença auto-imune subjacente, distúrbios hemorrágicos, trombose e/ou morbilidade da gravidez.

Todos os pacientes tiveram os seus soros recolhidos durante o seu exame clínico no Departamento de Reumatologia (Centro Médico Universitário, Ljubljana). As amostras foram aliquotadas, armazenadas a -20°C, e posteriormente analisadas. Este estudo foi realizado como parte do Programa Nacional de Pesquisa “Doenças Autoimunes Sistêmicas” (#P3-0314). Os participantes assinaram um consentimento informado e o estudo foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Médica, Ljubljana, Eslovênia.

2.2. LA Determination

Amostras de plasma foram analisadas usando o analisador de coagulação BCS Siemens de acordo com as diretrizes válidas no momento em que o estudo começou. O Teste Simplificado de Diluição do Viper Veneno de Russell (dRVVT) foi realizado usando reagente de triagem LA 1 e reagente de confirmação LA 2 (Siemens) seguindo as instruções do fabricante . Uma razão dRVVT (confirmação com ecrã LA1/LA2) acima de 1,2 foi considerada positiva para a actividade LA. A actividade de LA foi quantificada da seguinte forma: baixo positivo (LA1/LA2 = 1,2-1,5), médio (LA1/LA2 = 1,5-2,0), e alto positivo (LA1/LA2 > 2,0).

2,3. Um ELISA In-House aPS/PT

Foi realizado seguindo protocolo previamente descrito e método validado . Especificamente, os coeficientes médios de variação inter- e intra-ensaio foram <3,3% e <8,2%, respectivamente. A especificidade diagnóstica da TPA foi de 92,5% e a sensibilidade diagnóstica foi de 59,0%. O corte de relevância diagnóstica da APS/PT foi fixado no percentil 99 de 222 doadores de sangue. Resumidamente, a fosfatidilserina foi revestida em placas de microtítulo de poliestireno (ligação média, Costar, Cambridge, MA, EUA) e incubada durante a noite a 4°C. Após o bloqueio com Tris-buffered saline (TBS) contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 5 mM CaCl2 (1% BSA-TBS-Ca++) as placas foram lavadas em TBS contendo 0,05% de Tween-20. Protrombina humana (10 mg/L) (Enzyme Research Laboratories, UK) e soros de pacientes diluídos 1 : 100 em 1% BSA-TBS-Ca++ foram aplicados em poços imediatamente um após o outro e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente (RT). Posteriormente, as placas foram lavadas e incubadas com fosfato alcalino conjugado com IgG ou IgM (ACSC, Westbury, EUA) de cabra anti-humana (ACSC) durante 30 minutos à temperatura ambiente (RT). Após a última lavagem o para-nitrofenilfosfato (Sigma Chemical Company, EUA) em tampão dietanolamina (pH 9,8) foi aplicado como substrato e OD405 foi cine-medido cinéticamente pelo leitor de placas de microtítulo (Tecan, Grödig, Áustria).

2,4. IgG e IgM aCL

Estes foram determinados em soros por uma fase sólida interna aCL ELISA . Em resumo, placas de microtitulo de poliestireno (ligação média, Costar, Cambridge, MA, EUA) foram revestidas com cardiolipina (Sigma, St. Louis, EUA) e bloqueadas com soro bovino fetal a 10% (FBS) (Sigma, St. Louis, EUA) em solução fisiológica tampão fosfato (PBS). Após lavagem com PBS, foram aplicadas amostras diluídas em FBS-PBS a 10% e incubadas durante 2,5 horas em RT. O sistema de detecção foi o mesmo que em aPS/PT ELISA.

2,5. IgG e IgM Anti-GPI

Estes foram medidos por um ELISA interno. Brevemente, placas de microtítulo de poliestireno de alta ligação revestidas com 50 uL/bolo de GPI (10 mg/L) em PBS foram incubadas durante duas horas em RT. As placas foram então lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) e incubadas com amostras diluídas em PBS-Tween por 30 minutos em RT. O sistema de detecção foi o mesmo que em aPS/PT ELISA.

Todos os testes aPL foram realizados nas mesmas amostras de soros. Os pacientes e os controles foram testados ao mesmo tempo. Nenhum dos pacientes ou controles estava grávida no momento da determinação do aPL.

2,6. Análise estatística

Análise estatística foi realizada usando o programa SPSS 15.0. A análise da característica operacional do receptor (ROC) e a área sob a curva (AUC) foram utilizadas para avaliar o desempenho diagnóstico do(s) marcador(es) medido(s). Os resultados dos modelos de logística multivariada foram aproximados pelo odds ratio com seu intervalo de confiança de 95% (OR ). Um valor de 2 lados < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

3. Resultados

Todos os pacientes positivos para qualquer uma das LPA testadas foram testados novamente pelo menos 12 semanas após sua primeira visita e apenas níveis permanentemente elevados de LPA foram considerados como um resultado positivo. A prevalência de todos os testes de aPL é mostrada na Tabela 3. No total, 169 pacientes apresentaram morbidade gestacional definida pelos critérios do APS e 41 (24%) delas apresentaram positividade permanente para pelo menos uma das medidas de LPA. A maior prevalência foi encontrada para a ALC e aPS/PT (13%), enquanto a prevalência para LA e anti-GPI foi menor (7%) (Tabela 3). Onze pacientes (6,5%) foram positivos para aPS/PT e negativos para todos os outros testados para aPL. Seis deles tiveram abortos recorrentes antes do 10º GT, dois tiveram morte inexplicável de um feto morfologicamente normal depois do 10º GT, um teve parto prematuro, e dois tiveram abortos recorrentes e parto prematuro. Considerando os critérios laboratoriais de Sidney revisados da APS, 17,8% (30/169) dos pacientes foram positivos para LA ou aCL e/ou anti-GPI. Entre elas, 22 foram tratadas com heparina de baixo peso molecular (LMWH) e aspirina de baixa dose (LDA), o que resultou em uma gravidez bem sucedida. Seis mulheres não tiveram gravidezes subsequentes; três delas tiveram uma gravidez bem sucedida antes das complicações da gravidez com SPAs. Duas mulheres tiveram gestações únicas subseqüentes sem sucesso, apesar do tratamento anticoagulante. Quando adjacente, os resultados da APS/PT revelaram um adicional de 6,5% (11/169) de pacientes com resultado de gravidez adverso que foi positivo para a APL.

A frequência de aPL entre 42 pacientes que sofreram menos de três abortos antes do 10º WG (e não preencheram os critérios de classificação da APS) foi muito baixa e não mostrou diferenças em relação a mulheres saudáveis.

Análises estatísticas não puderam encontrar nenhuma associação de níveis mais elevados de aPL sendo mais fortemente associada a resultado adverso da gravidez.

Ao analisar cada uma das três categorias de morbidade de gravidez incluídas nos critérios de classificação da SAF, apenas anticorpos de SAF/PT foram estatisticamente associados de forma significativa a qualquer um dos três tipos de desfecho adverso de gravidez (, ajustado à idade) (Tabela 4). Na verdade, estes são os únicos aPL com frequência significativamente maior em pacientes com aborto recorrente antes do 10º GT, em comparação com mulheres saudáveis. Pelo contrário, os anticorpos anti-GPI não mostraram associação com qualquer tipo de morbidade na gravidez. aCL e LA estavam associados com complicações obstétricas aparecendo no final da gravidez; entretanto, não mostraram associação com morbidade no início da gravidez.

Análises com ajuste de idade foram realizadas a fim de estimar o risco relativo de resultado positivo em diferentes testes de aPL (LA, aCL, anti-GPI, e aPS/PT) para complicações obstétricas características para a APS apresentadas como OR com intervalo de confiança de 95%. Como mostrado na Tabela 5, apenas anticorpos aCL e aPS/PT apresentaram um risco elevado para complicações obstétricas (OR 7,4 e OR 7,4 , resp.).

No nosso grupo de 169 pacientes, 12 (6%) tinham um histórico de trombose e a prevalência de todas as LPA testadas foi maior entre eles, em comparação com os controles saudáveis (). A exclusão desses 12 pacientes das análises de regressão logística mostrou que as frequências de anticorpos aCL e aPS/PT ainda eram significativamente maiores quando comparadas aos controles saudáveis ( e , resp.).

4. Discussão

Embora vários estudos tenham avaliado a positividade da LPA em pacientes com histórico de trombose, apenas alguns estudos estabeleceram uma associação de diferentes LPA com anormalidades obstétricas individuais distintas para a LPA. Surge a questão se o mesmo perfil de aPL ocorre em pacientes com SAF com histórico de trombose em relação à SAF obstétrica. Há consenso geral para a triagem de LA, aCL e anti-GPI, mas o papel de outros auto-anticorpos permanece controverso. Portanto, foi sugerida a necessidade de realizar mais estudos de coorte a fim de determinar a incidência de LPA nãocrítica na perda da gravidez. Desde então, nosso grupo concentrou-se em avaliar a prevalência de anticorpos aPS/PT entre pacientes do sexo feminino que apresentaram diferentes complicações obstétricas durante sua gravidez.

Nós encontramos uma prevalência geral de aPS/PT de 13,0%, aCL de 12,4%, LA e anti-GPI menor que 8,0% em nosso grupo de pacientes com complicações obstétricas características para a APS. Tanto o aPS/PT quanto o aCL foram significativamente mais prevalentes em nossa coorte de pacientes em comparação com doadores de sangue saudáveis. Entretanto, o aCL correlacionou-se apenas com a morbidade e prematuridade tardia da gravidez, enquanto o aPS/PT foram os únicos anticorpos associados à perda recorrente precoce da gravidez, bem como com a morbidade e prematuridade tardia da gravidez. Nossos achados estão de acordo com Clark et al., que sugeriram que a perda recorrente precoce da gravidez associada ao aCL fosse retirada dos critérios de classificação devido à prevalência inconsistente do aCL nessa população e um conjunto crescente de evidências aponta para o fato de que essa manifestação clínica da SAF é distinta da perda tardia ou parto precoce com infarto da placenta. No entanto, de acordo com os nossos resultados, a determinação da aPS/PT em associação com a perda de gravidez recorrente precoce pode ser benéfica. Encontramos 7% (11/169) das pacientes com SAF/PT positivas e negativas para todas as outras APL testadas e 63% (7/11) delas tiveram perda de gravidez recorrente precoce. Apenas um estudo publicado também confirmou a associação de anticorpos antiprotrombina à perda precoce da gravidez; no entanto, diferiu do estudo actual na medida em que mediram aPT-A e incluíram doentes cuja gravidez terminou espontaneamente dentro do 20º GT. Considerando os critérios laboratoriais revistos de Sydney da APS, apenas 17,8% (30/169) das pacientes em nosso estudo foram positivas para LA ou aCL e/ou anti-GPI, mas quando a aPS/PT foi avaliada como parâmetro adicional, 24,8% (41/169) das pacientes foram aPL positivas.

Nós também determinamos a frequência da aPL entre 42 pacientes que sofreram menos de 3 abortos antes do 10º GT e não preencheram os critérios de classificação da APS. De acordo com nossas expectativas, a prevalência de todas as LPA neste grupo foi muito baixa (<7%) e não foi diferente das frequências encontradas em mulheres saudáveis.

A revisão da literatura revelou 12 estudos datados de 1997 a 2013. Mais da metade dos artigos foram publicados antes de 2006, quando novos critérios de classificação revisados foram aceitos. Cinco estudos testaram apenas anticorpos aPT-A, que são (de acordo com dados mais recentes) menos significativos para a APS . Entre cinco estudos maiores, recrutando mais de 100 pacientes, três mostraram associação significativa de aPS/PT ou aPT-A com complicações obstétricas; um não encontrou nenhuma associação significativa; entretanto, eles apenas mediram anticorpos aPT-A, e um foi realizado antes de 2006 e recrutou pacientes com mais de dois abortos recorrentes, ao invés de três. Dados conflitantes na literatura e a falta de estudos investigando o papel dos anticorpos antiprotrombina na SAF obstétrica levaram-nos a estudar a ocorrência desses anticorpos em diferentes resultados adversos precoces e tardios da gravidez. A prevalência geral de anticorpos contra aPS/PT em nosso estudo foi de 13,0%. Este número é maior que os relatados por Andreoli et al. que revisaram 120 estudos investigando LA, aCL e anti-GPI e forneceram uma frequência global de aPL estimada em 6% para a morbidade da gravidez. Estudos raros investigaram a significância clínica dos anticorpos antiprotrombina em relação ao desfecho obstétrico adverso. Akimoto et al. encontraram o título médio dos anticorpos antiprotrombina 1 em pacientes com abortos espontâneos ser maior do que em mulheres grávidas normais. Contudo, estudos subsequentes não demonstraram qualquer associação de anticorpos antiprotrombina (aPT ou aPS/PT) com perda de gravidez recorrente precoce. Bertolaccini et al. encontraram correlação entre a aPS/PT e a morte fetal além do 10º GT, mas não com a perda precoce da gravidez ou com a pré-maturidade. Marozio et al. relataram uma correlação positiva entre a aPT-A e o resultado adverso tardio da gravidez. Dois estudos recentes encontraram correlação entre a aPS/PT e anormalidades obstétricas, porém nenhum deles especificou os tipos de complicações na gravidez.

Nosso estudo não confirmou a associação nem do anti-GPI nem da AE com nenhum dos desfechos adversos da gravidez. Isso está de acordo com as conclusões da revisão sistemática, implicando que atualmente não há dados suficientes para estabelecer qualquer ligação significativa entre o anti-PGPI e a morbidade da gravidez. Além disso, no estudo de Clark et al. , que incluiu 2257 mulheres freqüentando uma clínica de gravidez de alto risco, menos de 1% das pacientes com aborto espontâneo precoce testaram positivo para AE, enquanto por outro lado as pacientes positivas para AE tinham um histórico significativamente mais freqüente de trombose. Possivelmente, LA e anti-GPI estão muito mais associadas à APS trombótica do que à APS obstétrica, enquanto aCL e aPS/PT parecem estar associadas aos dois tipos de APS.

A precisão diagnóstica da APL individual para perdas de gravidez definida pelos critérios de classificação da APS, determinados pela AUC, foi baixa, variando de 0,499 para anti-GPI a 0,549 para aCL ou aPS/PT (Tabela 5). Em nosso estudo anterior, a AUC para diferentes APL e APS (trombótica ou obstétrica) variou de 0,88 para IgG aCL a 0,55 para IgM anti-GPI, enquanto Otomo et al. determinaram AUC (para os critérios revisados de Sydney) como sendo de 0,688 . Certos pacientes com sintomas clínicos significativos para a APS, cumprindo os critérios clínicos, são negativos para todas as APL testadas e dentro deste grupo a APS/PT apesar da menor AUC poderia melhorar o diagnóstico da APS aumentando a sensibilidade da APL total.

Até agora, o mecanismo pelo qual os anticorpos antiprotrombina poderiam estar envolvidos na morbidade durante a gravidez não foi esclarecido. Entretanto, é muito provável que haja mais vias possíveis envolvidas. Tem sido sugerido que eles podem levar à perda de gravidez pela promoção de trombose microvascular da placenta, o que foi apoiado por achados histológicos . O trofoblasto placentário é o órgão principal no qual a fosfatidilserina é altamente exposta na cúspide externa da membrana. Durante a diferenciação embrionária e placentária ocorre uma ruptura da assimetria lipídica, levando à exposição da fosfatidilserina na superfície externa . Os anticorpos antiprotrombina podem cruzar a protrombina na superfície celular onde podem complicar a gravidez através da activação do complemento ou interferindo com a sinalização que parece ser um factor essencial para a manifestação da doença a partir dos resultados das experiências in vivo . Foi observado um aumento do número de eventos apoptóticos de células gigantes na ectoplacenta exposta à fosfatidilserina, o que pode levar a um desenvolvimento insuficiente da placenta, resultando em embrião pequeno para a data ou perda fetal. Por outro lado, foi observado que, em ratos, a protrombina desempenha um papel importante no desenvolvimento do embrião e que a deficiência de protrombina resulta em letalidade embrionária e neonatal. Não há dúvida de que o esclarecimento das vias nas quais os anticorpos antiprotrombina estão envolvidos na patogênese da SAF precisa ser mais investigado, mas, no entanto, foi demonstrado que as pacientes tratadas com SAF têm bons resultados na gravidez. Uma revisão feita por Marchetti et al. concluiu que o rastreamento de pacientes com SAF de alto risco é necessário para melhorar seus resultados de gravidez, e nós mostramos que o rastreamento do perfil da aPL incluindo aPS/PT, além da LA, aCL e anti-GPI, poderia permitir uma melhor avaliação de pacientes com SAF de alto risco e possivelmente prever mais perdas de gravidez. Da mesma forma, Ulcova-Gallova et al. sugeriram que a determinação da aPL somente contra a cardiolipina em pacientes com insuficiência reprodutiva não é suficiente para o diagnóstico de obstetrícia-ginecologia; portanto, a investigação da aPS/PT neste grupo de pacientes poderia ser justificada.

5. Conclusão

aPS/PT estão associados a resultados adversos de gravidez, independentemente de outros anticorpos antifosfolipídicos. Portanto, a medida do aPS/PT pode melhorar a avaliação de pacientes com perda de gravidez recorrente precoce, não descoberta por outros testes de aPL. Outros estudos, incluindo um maior número de pacientes com complicações na gravidez e/ou falência reprodutiva e doadores aparentemente saudáveis, são necessários para determinar os efeitos independentes de vários anticorpos antifosfolipídicos, bem como da aPS/PT, e confirmar o seu potencial uso na prática clínica.

A abreviaturas

Conflito de interesses

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Conhecimento

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério de Educação Superior, Ciência e Tecnologia da Eslovénia através do National Research Program Grant (no. P3-0314).