Análise revolucionária do gene gyrA da bactéria Neisseria meningitidis do complexo clonal 4821 coletado na China entre 1978 e 2016

Análise revolucionária de 77 seqüências de nucleotídeos gyrA do CC4821 N.cepas de meningitidis

Sete sete de novas sequências de gyrA de CC4821 N.meningitidis foram analisadas no contexto de 149 sequências de gyrA disponíveis publicamente (listadas na Tabela Adicional 1). Uma árvore filogenética vizinha foi construída com o conjunto de dados resultante de 226 seqüências de nucleotídeos de gyrA (Fig. 1). Uma árvore similar foi obtida usando o método de máxima verosimilhança (ML) (Figura Adicional 1). As seqüências nucleotídicas foram significativamente divergentes com uma distância p total de 0,045 (Tabela 1). Uma visão geral da árvore mostrou que as sequências das cepas de CC4821 N.meningitidis (em vermelho na Fig. 1) foram encontradas através da árvore demonstrando que o gene gyrA era relativamente divergente dentro dessas cepas.

Neighbor juntando a árvore filogenética de 226 sequências do gene gyrA de cepas Neisseria. O nome da cepa é indicado da seguinte forma: nome da espécie – cepa ID-ST-CC-Serogrupo país da coleção ano da coleção fenótipo de resistência CIP. A informação em falta é indicada por um espaço vazio. Por exemplo, N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Alemanha-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Coréia do Sul-2017. Os nomes sequenciais das cepas CC4821 N.meningitidis são indicados em fonte vermelha. As 77 sequências geradas neste estudo estão sublinhadas. As sequências de 9 cepas de referência são indicadas por um ponto preto. Os valores de Bootstrap > 70% são indicados. Valores de Bootstrap < 70% são indicados entre parênteses quando necessário. Os 9 grupos genéticos identificados neste estudo são indicados como linhas verticais entre parênteses. O fenótipo de resistência CIP é indicado com R para resistência, S para sensível e I para fenótipo de resistência intermediária

Dentre as 226 sequências analisadas, quase 62% das sequências (140) foram encontradas no topo da árvore, sem valor de bootstrap significativo (Fig. 1). Essas seqüências foram altamente homogêneas, com p-distância de 0,003 (Tabela 1). As restantes 86 sequências foram mais divergentes, com uma p-distância de 0,066 em relação às sequências agrupadas no topo da árvore. A maioria dos nós relativos a estas 86 sequências apresentava um valor de bootstrap > 70%. Além disso, a distância p dentro deste grupo de 86 sequências foi de 0,09, demonstrando que estas sequências eram altamente divergentes entre si. Como os nós principais da árvore apresentavam um valor de bootstrap > 80%, decidimos arbitrariamente atribuir sequências a 9 grupos genéticos diferentes (Fig. 1; Tabela 1). Esses 9 grupos também foram encontrados na árvore ML (Figura Adicional 1). As seqüências gyrA das cepas CC4821 foram encontradas em 6 desses grupos genéticos, ou seja, grupos 1, 2, 3, 5, 6 e 8,

Grupo 1 consistiu de 2 seqüências, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 e N.subflava-CP031251.1-M18660—- 2009. Este grupo foi apoiado por uma bootstrap de 100% sugerindo que estas 2 sequências eram muito diferentes do resto das sequências. As sequências partilharam 7 mudanças de amino (Tabela 1, Tabela Adicional 2). Entretanto, o ramo longo correspondente ao N.subflava-CP031251.1-M18660—- 2009 sugeriu que esta sequência também era significativamente diferente do N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 e isto foi confirmado por uma distância p-distância de 0,06 entre estas 2 sequências (Tabela 1).

Grupo 2 consistiu de 2 sequências de N.estirpes de meningitidis recolhidas na província de Gansu e Guangxi na China em 2007 e 2011, nomeadamente N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R e N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Grupo 3 consistiu de uma única sequência, nomeadamente, N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. O nó correspondente a esta seqüência foi suportado por um valor de 80% de bootstrap. Além disso, o par mais baixo entre esta sequência e as outras sequências analisadas foi 0,032, demonstrando que esta sequência foi significativamente divergente em relação ao resto das sequências analisadas (Tabela 1).

Grupo 5 consistiu de 26 sequências, principalmente de N.meningitidis incluindo 9 de CC4821. Um subgrupo de 7 sequências suportadas por uma bootstrap de 100% apresentava 5 sequências de N.lactamica. Curiosamente, N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 agrupado com sequências de N.lactamica com uma bootstrap de 100% e um ramo longo.

Grupo 6 consistiu de 27 sequências de N.lactamica.meningitidis (8 de CC4821) e 1 sequência de N. cinerea, nomeadamente N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, que partilhava um nó com N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. No entanto, a sequência de N.cinerea apresentava um ramo longo sugerindo uma divergência significativa em relação à sequência de N.meningitidis. Com base nos dados disponíveis, as sequências do grupo 6 pareciam ser de estirpes resistentes ao CIP. Entretanto, nenhuma substituição única de aminoácidos foi compartilhada por essas cepas sugerindo que não havia um marcador comum para o fenótipo de resistência dessas cepas (Tabela adicional 2).

Grupo 8 continha a maioria das sequências de N.meningitidis (64%) analisadas neste relatório. As cepas foram coletadas nos últimos 88 anos em 13 países diferentes de 4 continentes. Apesar do significativo período de tempo e distribuição geográfica, estas sequências foram altamente conservadas com uma p-distância de 0,003. Além disso, estas sequências foram obtidas a partir de cepas de 68 ST, 24 CC, 9 serogrupos, incluindo a cepa de referência 053442. Em geral, essas observações mostraram que o gene gyrA foi altamente conservado entre a maioria das cepas de N.meningitidis apesar das diferentes características genéticas, localizações geográficas ou tempo de coleta.

Análise da divergência dentro da proteína GyrA

A divergência de aminoácidos dentro da proteína GyrA foi analisada entre 129 sequências únicas (Tabela adicional 2). Duzentas e cinquenta e sete posições divergentes foram identificadas entre os 931 aminoácidos apresentados no alinhamento (Fig. 2). Embora estes locais tenham sido encontrados através da proteína, a distribuição da divergência não pareceu ser aleatória. Na verdade, duas regiões foram altamente conservadas, das posições 530 a 620, e uma região menor, entre 300 e 330. Segundo a proteína de E.coli, a primeira região corresponde ao fim do domínio do amino terminal e ao início do domínio do terminal carboxi. A segunda região corresponde ao domínio torre da proteína baseada na estrutura do modelo 3D (Fig. 2).

divergência de aminoácidos entre a proteína GyrA baseada em 129 sequências únicas. As posições dentro do alinhamento longo dos 932 aminoácidos são indicadas no eixo X. A percentagem de sequências com uma determinada posição divergente é indicada no eixo Y (lado esquerdo). Por exemplo, 58% das seqüências apresentam uma mutação na posição 91. O gráfico de divergência foi gerado a partir da tabela de diferenças de aminoácidos apresentada na Tabela Adicional 2. O alinhamento apresenta 10 intervalos e o número de sequências com intervalos é indicado no eixo direito e mostrado como um quadrado preto. Um mapa da proteína E.coli GyrA com domínios estruturais e funcionais é mostrado na parte inferior para comparação. O mapa foi gerado com base nas seguintes referências . A sequência de proteínas GyrA de E.coli e N.meningitidis da estirpe de referência 053442 (GB-ID CP000381) foram comparadas (Tabela adicional 4). O local conhecido resistente ao CIP em E.coli é mostrado e as posições correspondentes em N.meningitidis são indicadas com uma linha azul. Vale notar que entre os 8 locais resistentes relatados em E.coli, apenas as posições 83 e 87 são divergentes em N.meningitidis (locais 91 e 95)

Entre as 257 posições divergentes, nenhuma foi compartilhada por todas as seqüências giroscópicas analisadas das cepas CC4821. Cinco locais (91, 417, 665, 210 e 288) eram altamente divergentes, 40% ou mais das 129 sequências foram mutadas nessas posições. Por exemplo, 48% das 129 sequências apresentaram um resíduo mutado na posição 417 (Fig. 2). Uma posição (91) parecia estar ligada à resistência ao CIP, todas as cepas que não eram sensíveis ao CIP sofreram mutação nessa posição, apresentando um I ou um F ou um V (Tabela Adicional 2).

Identificação de marcadores de resistência potencial ao CIP

Dentre as 226 seqüências analisadas, 174 foram de cepas testadas para resistência ao CIP (Tabela Adicional 1). Sessenta e sete cepas foram testadas para este estudo. Como mencionado acima, todas as cepas não sensíveis à CIP (seja com um fenótipo resistente (R na árvore) ou fenótipo intermediário (I na árvore)) foram mutadas na posição 91. Isso mostrou que uma mutação na posição 91 estava ligada ao mecanismo de resistência. Entre as 67 cepas testadas neste estudo, 49 foram mutadas na posição 91, mas 23 dessas cepas tinham um fenótipo de resistência intermediária. Isto sugeriu que outras posições poderiam estar envolvidas no mecanismo de resistência. A fim de identificar potenciais marcadores adicionais de resistência, as 226 cepas foram analisadas posteriormente em cada posição mutante. Uma mudança que seria encontrada nas cepas resistentes (incluindo fenótipo de resistência intermediária), mas não encontrada em nenhuma cepa sensível, se qualificaria. Entretanto, para aumentar a severidade da análise, uma mutação encontrada em apenas uma cepa não seria considerada. No total, foram identificados 33 locais (Tabela Adicional 3; lado esquerdo da Tabela Adicional 4). Por exemplo, H8N foi encontrado em 18 cepas resistentes (incluindo 2 com fenótipo intermediário), mas não foi encontrado em nenhuma cepa sensível. Todas as 226 cepas foram analisadas para estas 33 posições. Mais uma vez, para aumentar a severidade da análise, uma mutação encontrada em pelo menos uma estirpe sensível seria descartada. Assim, a mutação D95N encontrada em cepas resistentes e sensíveis não foi mais considerada. Ao todo, 39 mutações (algumas na mesma posição como a posição 91) foram analisadas (em verde no lado esquerdo da Tabela Adicional 4). Um perfil de mutação foi construído para as 128 cepas com pelo menos uma mutação de interesse (Tabela Adicional 3). Quarenta e seis perfis diferentes foram identificados, o que significa que havia 46 combinações dessas 39 mutações entre todas as cepas analisadas (no lado direito da Tabela Adicional 4). Dezesseis dos 46 perfis de mutação diziam respeito às cepas CC4821 (números em vermelho na Tabela Adicional 4). Vinte e seis perfis diziam respeito a cepas que eram conhecidas por serem resistentes ao CIP (nomes das cepas em fonte azul na Tabela Adicional 4). Entre os 39 marcadores de resistência potencial, as mutações N103D e T91I foram as mais compartilhadas nos perfis com 29 e 27 aparências, respectivamente. Entretanto, vale ressaltar que outras mutações também foram bem representadas como H8N, I111V, E793Q e A679S com 23, 21, 18 e 17 aparecimentos, respectivamente. Vale ressaltar também que 45% das cepas resistentes (58 de 128) apresentavam apenas a mutação T91I. Como os marcadores de resistência foram inicialmente descritos em E.coli, uma comparação entre as sequências de gyrA de E.coli e a estirpe de referência N.meningitidis 53.442 foi necessária para verificar a posição desses marcadores na sequência de E.coli (Tabela adicional 5).

Recombinação dentro do gene gyrA entre N. spp.

A análise filogenética identificou potenciais recombinantes. Por exemplo, o grupo 1 foi de particular interesse, referente ao N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 e N.subflava-CP031251.1-M18660. Estas 2 sequências partilharam 7 alterações de resíduos, não observadas em outras estirpes. Além disso, 5 dessas mudanças foram observadas dentro de 30 aminoácidos (Tabela 1). Finalmente, as mudanças de aminoácidos observadas em uma cepa não foram vistas na outra, como as posições 740 e 750. Todas estas observações sugeriram uma recombinação entre estas 2 cepas, o que foi confirmado por uma análise BootScan (Fig. 3a). Três outras potenciais recombinações foram confirmadas pelo BootScan. Fig. 3b descreveu uma recombinação entre uma cepa CC4821 (provavelmente N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 ou N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) e N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Fig. 3c apresentava eventos de recombinação múltipla entre N.lactamica-CP031253.1-M17106—– e duas cepas de N.meningitidis, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– e N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Finalmente, uma recombinação entre as cepas de N.meningitidis foi apresentada na Fig. 3d. Ao todo, a análise de recombinação mostrou que o gene gyrA das cepas Neisseria é altamente propenso à recombinação.

Eventos potenciais de recombinação inter- e intra-espécie entre as cepas Neisseria. a. Recombinação entre N.subflava e N.meningitidis. Um gráfico BootScan foi gerado em SimPlot com N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 como uma consulta. b. Recombinação entre N.cinerea e N.meningitidis. Um gráfico BootScan foi gerado em SimPlot com N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R como uma consulta. c. Recombinação entre N.lactamica e N.meningitidis. Um gráfico BootScan foi gerado em SimPlot com N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 como uma consulta. d. Recombinação entre cepas de N.meningitidis. Um gráfico BootScan foi gerado em SimPlot com N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 como uma consulta. A estirpe que se prevê contribuir mais no processo de recombinação (backbone) é mostrada como uma linha vermelha. A estirpe de referência N.meningitidis 053442 (GB ID CP000381) é mostrada como uma linha preta. Um mapa funcional para a estirpe de referência 053442 é mostrado acima baseado no mapa funcional E.coli mostrado na Fig. 2