A importância das bombas de efluxo na resistência bacteriana aos antibióticos

As bombas de efluxo transportam proteínas envolvidas na extrusão de substratos tóxicos (incluindo praticamente todas as classes de antibióticos clinicamente relevantes) do interior das células para o ambiente externo. Estas proteínas são encontradas tanto em bactérias Gram-positivas e -negativas quanto em organismos eucarióticos.1 As bombas podem ser específicas para um substrato ou podem transportar uma gama de compostos estruturalmente diferentes (incluindo antibióticos de múltiplas classes); tais bombas podem ser associadas à resistência a múltiplas drogas (MDR). No reino procariótico existem cinco grandes famílias de transporte de efluxo:2 MF (principal facilitador), MATE (multi-drogas e efluxo tóxico), RND (resistance-nodulation-division), SMR (pequena resistência multi-drogas) e ABC (cassete de ligação ATP). Todos estes sistemas utilizam a força motriz do próton como fonte de energia,3 além da família ABC, que utiliza a hidrólise de ATP para impulsionar a exportação de substratos. Os recentes avanços na tecnologia do DNA e o advento da era genómica levaram à identificação de numerosos novos membros das famílias acima referidas, sendo notável a natureza omnipresente das bombas de efluxo. Os transportadores de efluxos múltiplos substratos, incluindo antibióticos, não evoluíram em resposta às tensões da era antibiótica. Todos os genomas bacterianos estudados contêm várias bombas de efluxo diferentes, o que indica a sua origem ancestral. Foi estimado que ∼5-10% de todos os genes bacterianos estão envolvidos no transporte e uma grande proporção destes codifica bombas de efluxo.2,4

Há algum debate sobre o papel fisiológico “normal” dos transportadores de efluxo, uma vez que bactérias suscetíveis a antibióticos, bem como bactérias resistentes, carregam e expressam estes genes. Em muitos casos, os genes das bombas de efluxo são parte de um operon, com uma expressão reguladora de controle dos genes. O aumento da expressão está associado à resistência aos substratos, por exemplo, a resistência aos sais biliares e alguns antibióticos na Escherichia coli é mediada pela superexpressão da acrAB.5 Embora genes codificadores de bombas de efluxo possam ser encontrados em plasmídeos, o transporte de genes de bombas de efluxo no cromossomo dá à bactéria um mecanismo intrínseco que permite a sobrevivência em um ambiente hostil (por exemplo, a presença de antibióticos), e assim bactérias mutantes que super-expressam os genes de bombas de efluxo podem ser selecionadas sem a aquisição de novo material genético. É provável que estas bombas tenham surgido para que substâncias nocivas possam ser transportadas para fora da bactéria, permitindo a sobrevivência. De facto, é agora amplamente aceite que a “resistência intrínseca” das bactérias Gram-negativas a certos antibióticos em relação às bactérias Gram-positivas é um resultado da actividade dos sistemas de efluxo.6 Os sistemas de efluxo que contribuem para a resistência aos antibióticos têm sido descritos a partir de várias bactérias clinicamente importantes, incluindo Campylobacter jejuni (CmeABC7,8), E. coli (AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, EmrB, EmrD9), Pseudomonas aeruginosa (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM9), Streptococcus pneumoniae (PmrA10), Salmonella typhimurium (AcrB11) e Staphylococcus aureus (NorA12). Todos estes sistemas fluoroquinolonas e as bombas RND (CmeB, AcrB e as bombas Mex) também exportam múltiplos antibióticos.

A sobre-expressão das bombas de efluxo pode resultar de mutações nos genes repressores locais13-15 ou pode resultar da ativação de um regulador regulado por um regulador transcripcional global como MarA ou SoxS de E. coli.16,17 A ampla gama de substratos dos sistemas de efluxo é preocupante, pois muitas vezes a sobre-expressão de uma bomba resultará em resistência a antibióticos de mais de uma classe, bem como a alguns corantes, detergentes e desinfectantes (incluindo alguns biocidas comumente utilizados). A resistência cruzada também é um problema; a exposição a qualquer agente que pertença ao perfil do substrato de uma bomba favoreceria a sobre-expressão dessa bomba e a consequente resistência cruzada a todos os outros substratos da bomba. Estes podem incluir antibióticos clinicamente relevantes. Um exemplo disto é visto novamente com o sistema mexAB de P. aeruginosa; mutantes que produzem em excesso MexAB são menos susceptíveis, se não totalmente resistentes a uma gama de antibióticos (fluoroquinolonas, β-lactams, cloranfenicol e trimetoprim) mas também triclosan, um biocida doméstico comumente usado.18 O potencial mau uso dos biocidas e a possível selecção de bactérias resistentes a antibióticos tem sido debatido recentemente nesta revista e noutras publicações.19-22 A sobre-expressão de uma bomba de efluxo multirresistente não confere frequentemente uma resistência clinicamente significativa e de alto nível aos antibióticos. Entretanto, tais bactérias estão mais bem equipadas para sobreviver à pressão antibiótica e desenvolver mais mutações nos genes que codificam os locais alvo dos antibióticos.23 Foi demonstrado que as cepas de E. coli resistentes à fluoroquinolona são selecionadas 1000 vezes mais facilmente de mutantes mar do que as bactérias tipo selvagem,24 e E. coli altamente resistentes à fluoroquinolona contêm mutações nos genes que codificam as enzimas topoisomerase alvo e têm reduzido o acúmulo e aumentado o efluxo (regulação de poros para baixo e sobre-expressão da bomba de efluxo).14,15 Aumentos de aditivos em MICs de antibióticos também foram observados após superexpressão simultânea de mais de uma bomba de diferentes classes, resultando também em E. coli altamente resistente.25

Foi demonstrado que a expressão dos sistemas mexicanos de P. aeruginosa e o sistema de efluxo acrAB de E. coli é maior quando as bactérias estão estressadas, por exemplo, crescimento em um meio pobre em nutrientes, crescimento para fase estacionária ou choque osmótico; estas condições inóspitas podem ser relevantes para a situação dentro de uma infecção.26,27 A sobre-expressão não regulada das bombas de efluxo é potencialmente desvantajosa para a bactéria, uma vez que não só os substratos tóxicos serão exportados, como também os nutrientes e os intermediários metabólicos poderão ser perdidos. O trabalho com a P. aeruginosa sugeriu que as bombas mexicanas de sobre-expressão mutantes são menos capazes de suportar o stress ambiental e são menos virulentas do que as suas contrapartes do tipo selvagem.28 Como resultado, a expressão das bombas é rigorosamente controlada. No entanto, mutantes e isolados clínicos que as bombas de efluxo de sobre-expressão são estáveis e comumente isolados; pode ser que tais mutantes acumulem mutações compensatórias permitindo que eles cresçam assim como bactérias do tipo selvagem.

Recentemente, o uso de inibidores da bomba de efluxo tem sido investigado a fim de melhorar e potencializar a atividade dos antibióticos exportados. Tal estratégia tem sido utilizada para desenvolver inibidores que reduzem o impacto das bombas de efluxo na atividade da fluoroquinolona. Como muitas bombas de efluxo possuem uma homologia estrutural significativa, espera-se que um composto inibidor seja ativo contra uma gama de bombas de diferentes espécies bacterianas. A maioria das pesquisas tem se concentrado nas bombas de efluxo P. aeruginosa Mex e seus inibidores. Um desses inibidores reduziu os valores de MIC de fluoroquinolonas tanto para cepas sensíveis quanto resistentes.2 Além disso, a freqüência de seleção de cepas resistentes à fluoroquinolona também foi menor na presença do inibidor, sugerindo que o efluxo pode ser importante na seleção da resistência à fluoroquinolona. Observações semelhantes foram feitas para S. pneumoniae e S. aureus.29,30 A exigência de um sistema de efluxo intacto para permitir o desenvolvimento de mutações da topoisomerase e conseqüente resistência à fluoroquinolona na E. coli também foi descrita.31 A ligação entre efluxo ativo e mutações nos genes que codificam as proteínas do local alvo sugere que o uso de tais inibidores, em associação com antibióticos de substrato, pode ser útil aumentando tanto a atividade quanto a gama de espécies para as quais um medicamento pode ser eficaz. O desenho de novas drogas e a modificação das moléculas existentes também deve ser feito agora com as bombas de efluxo em mente. Alterações estruturais que reduzem a capacidade de um antibiótico ser efluído sem comprometer sua atividade podem levar ao desenvolvimento de compostos mais potentes, certamente a “efluxabilidade” dos medicamentos deve agora ser considerada, uma vez que os agentes são desenvolvidos em relação à sua eficácia geral e à probabilidade de desenvolvimento de resistência.

Para concluir, há cada vez mais evidências de que o papel das bombas de efluxo na resistência aos antibióticos nas bactérias é significativo. Embora a resistência de alto nível possa não ocorrer apenas como resultado das bombas de efluxo MDR, a associação da superexpressão desses genes entre isolados clínicos altamente resistentes não pode ser ignorada. A resistência intrínseca a antibióticos de certas espécies também pode ser devida, em grande parte, às bombas de efluxo. A selecção de mutantes de efluxo pelos biocidas encontrados no ambiente é uma preocupação potencial; é necessário mais trabalho para quantificar o risco, se houver, de tal processo. Os aumentos sinérgicos de resistência observados com a sobre-expressão do(s) sistema(s) de efluxo, bem como as mutações do local alvo, podem levar a bactérias altamente resistentes que são difíceis de tratar. O efeito das bombas de efluxo precisa ser considerado no desenho de futuros antibióticos e o papel dos inibidores avaliados para maximizar a eficácia dos antibióticos atuais e futuros.

Para os interessados, há uma série de excelentes artigos de revisão focando em bombas de efluxo.2,3,9,11,32,33