A electroacupunctura atenua o stress oxidativo hepático e renal em ratos anestesiados

13 -ARTIGO ORIGINAL
METABOLISMO

Electroacupuntura atenua o stress oxidativo hepático e renal em ratos anestesiados1

Eletroacupuntura atenua o stress oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

Fellow Master, Departamento de Cirurgia, Programa de Pós-Graduação, UFC, Ceará, Brasil. Procedimentos técnicos, aquisição e interpretação de dados. O artigo é parte de uma dissertação de mestrado (AHS)
II aluno de pós-graduação, UFC, Ceará, Brasil. Auxiliado com procedimentos técnicos, aquisição de dados
IIIPhD, Professor Associado, Coordenador, Programa de Pós-Graduação, Departamento de Cirurgia, UFC, Ceara, Brasil. Revisão crítica e interpretação de dados
IVPhD, Professor Associado, Departamento de Cirurgia, Chefe, LABCEX, UFC, Ceara, Brasil. Tutor, concepção, desenho, conteúdo intelectual e científico do estudo, redação de manuscritos, análise estatística

Correspondência

ABSTRACT

PURO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) em acupontos Zusanli (ST-36) e Zhongwan (CV-12) combinados na regulação do estresse oxidativo no fígado e nos rins em ratos anestesiados.
METHODS: Dezoito ratos saudáveis aleatoriamente atribuídos a 3 grupos (n=6) foram anestesiados intraperitonealmente com cetamina (90mg kg-1 peso corporal) + xilazina (10mg/kg de peso corporal): G-1: Controlo (anestesia), G-2: anestesia+EA10Hz e 10 mA, 10 Hz) aplicados nos acupontos ST-36 e CV-12 direitos durante 30 minutos. G-3 foi igualmente tratado, usando uma frequência dez vezes superior (100 Hz). Atividade de G6PDH, níveis de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH) foram testados espectrofotometricamente.
RESULTADOS: As concentrações de MDA e GSH do fígado aumentaram significativamente em ratos submetidos à EA 10Hz (p<0,01) e EA 100Hz (p<0,001), em comparação com o controle G-1. A atividade do fígado e dos rins G6GPH diminuiu significativamente em G-2 (p<0,01) e G-3 (p<0,001), em comparação com G-1 em ratos EA 100Hz. Um padrão similar foi encontrado na atividade do G6PDH renal em ratos EA10Hz.
CONCLUSÃO: Uma única sessão de 30 minutos EA 10/100Hz aumenta a peroxidação lipídica e simultaneamente reduz o stress oxidativo nos tecidos hepáticos e renais em um modelo de rato.

Keywords: Acupunctura. Electroacupunctura. Peroxidação lipídica. Stress oxidativo. Ratos.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, na regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
MÉTODOS: Dezoito ratos sadios, distribuídos aleatoriamente em três grupos (n = 6), foram anestesiados com cetamina (90mg/kg de peso) + xilazina (10mg/kg de peso): G-1: Controle (anestesia), G-2: anestesia + EA10Hz e G-3: anestesia + EA100Hz. Os ratos do grupo G-2 foram submetidos à EA (ondas quadradas pulsadas, 10 mA, 10 Hz) aplicada aos acupontos ST-36 direito e VC-12 por 30 minutos. Nos ratos do grupo G-3 utilizou-se uma freqüência dez vezes maior (100 Hz). A atividade da enzima G6PDH e as concentrações de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH) foram verificadas por espectrofotometria.
RESULTADOS: As concentrações hepáticas de MDA e GSH aumentaram significativamente nos ratos submetidos à EA, utilizando 10Hz (p <0,01) e 100Hz (p <0,001), comparado com o controle. A atividade de G6GPH diminuiu significativamente no G-2 (p <0,01) e G-3 (p <0,001) no fígado e no rim em comparação ao grupo G-1 em ratos tratados com 100Hz.
CONCLUSÃO: Uma única sessão de EA 10/100Hz por 30 minutos aumenta a peroxidação lipídica e simultaneamente reduz o estresse oxidativo no fígado e no rim de ratos sadios.

Descritores: Acupuntura. Eletroacupuntura. Peroxidação de Lipídeos. Estresse Oxidativo. Ratos.

Introduction

Manual acupuncture (MA) is one of the main forms of treatment in traditional Chinese Medicine. It involves the use of sharp, thin needles that are inserted in the body at very specific points (acupoints). MA has been used for several millennia in oriental countries and is being increasingly accepted by practitioners and patients in the West as well1. Electroacupuncture (EA) is a modification of this technique where small electrical currents are applied to needles previously inserted in the body and appears to have more consistently reproducible results in many specific clinical and research settings2-4. A EA aplicada ao acuponto Zusanli (ST-36) reduz a peroxidação lipídica em modelos experimentais de isquemia/reperfusão como a medula espinhal de rato5, cérebro6 e soro sanguíneo7 e músculo cardíaco de porco8.

Chakrabarti et al.9 investigaram o efeito do tratamento de eletroacupuntura simples, agudo (7 pulsos/seg., 0,75 volts) e crônico (4 pulsos/seg., 0,75 volts) em dias alternados por um período de 21 dias sobre as funções hepáticas de ratos. Foram utilizadas duas acupunções dorsais juntamente com ST-36. Após o tratamento crônico, o valor de peroxidação dos microssomais lipídicos do fígado diminuiu significativamente. Além disso, dado que a estimulação manual do acuponto ST-36 é capaz de atenuar a lesão renal induzida pela sepse10, é possível que a estimulação elétrica desse acuponto possa alterar as concentrações de MDA, um indicador de lesão da membrana celular, no tecido renal.

Processos fisiológicos são regulados por enzimas. O NADPH é o principal redutor intracelular e sua produção depende principalmente da glucose-6-fosfato-desidrogenase. Se a atividade do G6PDH for inibida, há uma diminuição simultânea da atividade do NADPH, uma coenzima que é essencial para a proteção contra danos oxidativos. A integridade das células, bem como todo o sistema antioxidante, depende do fornecimento adequado de NADPH11. Muitos trabalhos têm demonstrado os efeitos da MA e EA no acuponto ST-36 na atenuação do estresse oxidativo em diferentes doenças experimentais5-9. Além disso, o uso de cetamina+xilazina, uma mistura anestésica frequentemente utilizada em estudos experimentais, pode induzir algum grau de estresse oxidativo em um animal saudável12-13,

Foi previamente demonstrado que grandes quantidades de peptídeos opióides endógenos são secretados das glândulas supra-renais quando acupontos CV-12 são estimulados usando acupuntura com 2Hz14. Quando uma EA de alta freqüência (15 Hz) foi aplicada para estimular o acuponto CV-12, múltiplas fontes de peptídeos opióides endógenos foram descobertas15. Assim, o objetivo foi investigar se a aplicação da EA, estimulando os acupontos ST36 e CV-12, usando duas frequências diferentes, 10 Hz e 100 Hz, pode modificar o conteúdo de MDA e GSH do fígado e do rim e se há diferença na peroxidação lipídica e no estresse oxidativo entre 10 Hz e 100 Hz EA em roedores saudáveis.

Métodos

Preparação anímica

Ratos Wistar machos pesando 280-400 g, fornecidos pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, foram mantidos sob condições ambientais controladas (24°C _humidade relativa 40%-60%, ciclos luz-escuro alternados de 12 horas, alimentação e água ad libitum). O equivalente dos acupontos ST-36 e CV-12 foram escolhidos para agulhamento e estimulação elétrica. A nomenclatura de acupontos utilizada segue a nomenclatura da OMS16. O acuponto ST-36 está localizado 5mm abaixo da cabeça da fíbula sob a articulação do joelho, e 2mm lateralmente ao tubérculo anterior da tíbia. A punção do acuponto ST-36 estimula o nervo cutâneo sural lateral, o ramo cutâneo do nervo safeno e, mais profundamente, o nervo peroneal profundo17-18. O acuponto CV-12 está localizado na linha média anterior do abdômen superior, 20 mm abaixo da sincondrose esternal. Essa região é inervada pelo ramo cutâneo anterior do 8º nervo intercostal18,

Materiais

Agulhas descartáveis de aço inoxidável (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Korea) foram utilizadas. O eletroestimulador EL-608 foi adquirido da NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brasil.

Grupos experimentais

Animais foram anestesiados intraperitonealmente com uma mistura fresca preparada de cetamina (90mg kg/peso corporal) e xilazina (10mg kg/peso corporal). Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos iguais da seguinte forma:

* Grupo 1 (anestesia) – 6 ratos

* Grupo 2 (EA 10Hz) – 6 ratos

* Grupo 3 (EA 100Hz) – 6 ratos

Grupo 1 (Controle) os ratos foram anestesiados conforme descrito. Sessenta minutos depois, o abdômen dos ratos foi aberto e o fígado e os rins direitos foram removidos. Os ratos do grupo 2 (EA10Hz) foram anestesiados conforme descrito. Após desinfecção cutânea de rotina com agulhas descartáveis de aço inoxidável esterilizadas com etanol a 75% (0,25 mm × 30 mm) foram inseridas perpendicularmente até 2-3 mm de profundidade em acupontos ST-36 e CV-12 à direita. Os eletrodos foram conectados a ambas as agulhas e a um eletroestimulador (NKL EL-608); ondas quadradas pulsadas, 10 Hz, 10 mA foram aplicadas por 30 minutos. As amostras foram coletadas 30 minutos depois. O grupo 3 (EA100Hz) ratos foram submetidos à EA como grupo 2. Entretanto, foi utilizada uma freqüência dez vezes maior (100 Hz).

Determinações bioquímicas

Parâmetros determinados incluíram atividade de G6PDH, concentração de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH). As amostras de tecido foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em tubos de vidro a -70º até posterior preparação e análise dos homogeneizados de fígado e rim. A peroxidação lipídica foi testada através da medição do malondialdeído como substância reativa ao TBA19. Em resumo, H3PO4 (1%, 3 mL) e solução aquosa de TBA (0,6%, 3 mL) foram adicionados ao homogeneizado a 10% (0,5 mL). O meio de ensaio foi agitado e aquecido em um banho de água fervente por 45 min. Após o arrefecimento, foram adicionados 4 mL de n-butanol e a mistura foi agitada. Após a separação da camada de n-butanol por centrifugação a 1200g durante 15 min, sua densidade óptica foi determinada em um espectrofotômetro (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, agora Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA) com 535 e 520 nm como comprimentos de onda de absorção, respectivamente. A diferença entre os resultados das duas determinações da densidade óptica foi tomada como valor TBA e a quantidade de malondialdeído (MDA) no testículo foi calculada, comparando com os padrões MDA e expressa em micromoles de MDA por grama de tecido úmido. Os níveis de GSH foram estimados pelo método de Sedlak e Lindsay20 que se baseia na reacção entre grupos de tiol e 5-5-dithiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) para produzir um composto que absorve a luz a 412 nm. A quantidade de GSH foi determinada a partir de uma curva padrão obtida simultaneamente sob as mesmas condições com várias concentrações de GSH. As actividades de G6PDH foram estimadas pelos métodos descritos anteriormente21. A atividade enzimática foi lida espectrofotometricamente.

Análise de dados

Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) foi utilizada para computação e análise estatística. Todos os resultados foram expressos como média±SD. Todos os dados foram testados para distribuição (teste de Kolmorogov-Smirnov com valor de Dallal-Wilkinson-Lilliefor P). Os testes ANOVA ou Kruskal-Wallis de uma via, conforme necessário, foram realizados para determinar diferenças entre os grupos nas concentrações de MDA e GSH e atividade de G6PDH nos tecidos hepáticos e renais. Na análise post hoc (Tukey ou Dunn), um valor de probabilidade de p<0,05 foi considerado para indicar significância estatística.

Resultados

EnsaioGSH

Concentrações de GSH hepático aumentaram significativamente em ratos submetidos à EA 10Hz e EA 100Hz (p<0,001), em comparação com o controle (Figura 1). Aumentos similares nas concentrações de GSH renal ocorreram tanto no grupo EA10Hz quanto no EA100Hz (Figura 2). Adicionalmente, as concentrações de GSH hepático e renal aumentaram significativamente em ratos tratados com EA100Hz em comparação com o grupo EA10Hz.

Ensaio MDA

Concentrações de MDA hepática aumentaram significativamente em ratos submetidos ao EA10Hz (p<0,01) e EA100Hz (p<0,001), em comparação com o grupo controle (Figura 3). Aumentos similares nas concentrações de MDA renal ocorreram tanto no grupo EA10Hz quanto no EA100Hz (Figura 4). As concentrações de MDA renal aumentaram significativamente no grupo EA100Hz em comparação com o grupo EA10Hz.

Ensaio G6PDH

Atividade do G6GPH de fígado diminuiu significativamente nos grupos EA100Hz (p<0,001) em comparação com o grupo controle (Figura 5). Um padrão similar foi encontrado na atividade renal do G6PDH em ratos EA10Hz. A atividade do G6PDH renal não foi diferente nos dois grupos (Figura 6).

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Discussão

Em nosso experimento o estresse oxidativo foi induzido pelo uso de cetamina, um agente anestésico dissociativo, freqüentemente utilizado durante procedimentos veterinários ou para fins experimentais. Alva et al.12 demonstraram que a cetamina leva ao aumento dos níveis de óxido nítrico plasmático, induz a acidose metabólica e causa danos oxidativos, embora sem atingir toxicidade hepática.

Foram demonstrados os efeitos antioxidantes da EA de baixa freqüência. Siu et al.6 electroestimularam os acupontos GB-20, localizados no aspecto posterior do pescoço, abaixo do osso occipital, na depressão entre o músculo esternocleidomastoideo e trapézio e o ST-36, usando múltiplas aplicações antes da isquemia cerebral e concluíram que a EA a 2Hz poderia regular parcialmente a peroxidação lipídica na isquemia cerebral. O GB-20 e o ST-36 tiveram uma eficácia benéfica semelhante6. No nosso estudo, o uso da EA induziu um aumento significativo na concentração de MDA no fígado (Figura 3) e no rim (Figura 4) nos grupos EA10Hz e EA100Hz. O aumento adicional da peroxidação lipídica ocorreu no grupo EA100Hz em comparação com os ratos EA10Hz. Isso sugere que o rim é mais suscetível à peroxidação lipídica do que o fígado. Parece que o uso de estimulação elétrica utilizando altas frequências em uma única sessão aumenta a peroxidação dos lipídios neste modelo de rato.

Yu et al.22 avaliaram o papel da estimulação com agulha de quatro acupontos diferentes: GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) e SP-10 (Xuehai) sobre a regulação do stress oxidativo no sistema nigrostriatal no rato lesionado com 6-hidroxidopamina e concluíram que a estimulação da acupuntura evitou a redução do nível de GSH assim como o aumento do nível de MDA.

Como estudamos os efeitos de uma única sessão de electroacupuntura enquanto em Yu et al.22 avaliaram os efeitos do tratamento clássico de acupuntura, realizado duas vezes ao dia durante 14 dias acreditamos que o uso de estimulação elétrica em uma única sessão poderia ser responsável pelo aumento dos níveis de MDA. Por outro lado, a EA usada em uma única sessão induziu um aumento significativo na concentração de GSH tanto no tecido hepático (Figura 1) quanto no renal (Figura 2). O efeito protetor da EA é maior em frequências mais altas, como demonstrado pelo aumento da concentração de GSH no rim de ratos EA100Hz, comparado aos animais EA10Hz.

G6PDH tem um papel muito importante na resposta celular ao estresse oxidativo. Até recentemente havia uma crença geral de que esta importância enzimática se limitava aos eritrócitos humanos que carecem de qualquer outra rota produtora de NADPH23. Observações recentes mostraram que o G6PDH desempenha um papel protetor contra espécies reativas de oxigênio em células eucarióticas que possuem rotas alternativas para a produção de NADPH24. Neste estudo a actividade do G6PDH diminuiu significativamente no fígado dos grupos EA10Hz e EA100Hz. Queda similar de atividade foi observada no rim de ratos EA10Hz. As concentrações de GSH renal aumentaram em ratos EA100Hz no momento em que foi demonstrada uma diminuição concomitante da G6PDH no mesmo grupo.

Yu et al.25 demonstraram que a ativação de G6PDH está inversamente correlacionada aos níveis intracelulares de GSH, utilizando culturas em suspensão celular de Taxus chinensis. É possível que células animais possam ter comportamento semelhante.

Como os pontos fortes e fracos deste estudo em relação a outros, não há nenhum estudo publicado que possa ser comparado diretamente com a presente pesquisa. Apesar dos efeitos peroxidativos da EA terem sido demonstrados aqui, em contraste com outros estudos6 , a electroestimulação de 10 Hz não foi utilizada por outros pesquisadores. Os estudos publicados utilizaram EA de baixa frequência (2 Hz), em múltiplas sessões. Em nosso estudo, foi utilizada uma única sessão. Por outro lado, a diminuição da atividade de G6PDH no fígado e nos rins de ratos tratados com 100 Hz e 10 Hz, respectivamente, juntamente com um aumento concomitante dos níveis de GSH, após uma única sessão de EA, sugerem que frequências mais altas poderiam induzir uma melhor proteção contra o estresse oxidativo. Os mecanismos envolvidos não são claros até agora. Outros estudos podem lançar nova luz sobre os efeitos protetores da eletroacupuntura.

Conclusão

Os dados coletados suportam a hipótese de que uma única sessão de 30 minutos de EA 10/100Hz aumenta a peroxidação lipídica e simultaneamente reduz o estresse oxidativo aumentando os níveis de GSH no fígado e nos tecidos renais em um modelo de rato.

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