Zróżnicowanie genomowe i międzykontynentalna struktura populacji wektorów komarów Culex pipiens pipiens i Culex pipiens molestus

Independent monophyletic origin of Culex pipiens pipiens pipiens and Culex pipiens molestus

Dwie alternatywne hipotezy zostały zaproponowane w celu wyjaśnienia różnic w ekologicznych i fizjologicznych strategiach Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus19. Jedna z hipotez tłumaczy takie zróżnicowanie jako gwałtowną zmianę cech fizjologicznych i behawioralnych jako adaptację do środowiska podziemnego, związanego z działalnością człowieka22. W tym scenariuszu, lokalne populacje Cx. p. molestus muszą być blisko spokrewnione z lokalnymi populacjami Cx. p. pipiens30. Scenariusz ten traktuje Cx. p. molestus jako ekofizjologiczną odmianę Cx. p. pipiens. Alternatywna hipoteza sugeruje, że różnice między Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus wynikają z odmiennej historii ewolucyjnej tych gatunków. Ekologiczne i fizjologiczne strategie Cx. p. molestus mogły najpierw powstać w ciepłym klimacie19 . Później taka strategia okazała się istotna z powodu działalności człowieka, który stworzył podziemne środowisko i w ten sposób rozprzestrzenił Cx. p. molestus na całym świecie. Ten scenariusz uznaje Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens za odrębne jednostki ewolucyjne.

W naszym badaniu przetestowaliśmy te hipotezy przy użyciu analizy całego genomu 40 próbek Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens zebranych z czterech lokalizacji w Eurazji i Ameryce Północnej. Nasze wyniki odrzuciły hipotezę o reemigracji Cx. p. molestus z lokalnych populacji Cx. p. pipiens i silnie wsparły ideę niezależnego monofiletycznego pochodzenia zarówno Cx. p. pipiens jak i Cx. p. molestus z różnych kontynentów. Analizy NJ i ML oddzielnie grupują Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus z Republiki Białorusi, Republiki Kirgiskiej i Chicago, IL, USA (ryc. 2, ryc. 1-3). Obecność dodatkowego skupiska hybrydowego utworzonego przez autogeniczne i anautogeniczne osobniki zebrane w terenie z Waszyngtonu, D.C., USA, bardziej prawdopodobnie odzwierciedla istnienie strefy hybrydy Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus na tym obszarze16. Jednakże, na podstawie odległości genetycznych, skupisko to jest znacznie bliżej spokrewnione z euroazjatyckim Cx. p. pipiens niż z Cx. p. molestus z Eurazji i USA (Chicago, IL). Dodatkowo, analizy PCA (ryc. 3) i ADMIXTURE (ryc. 4) pozwoliły na wyodrębnienie dwóch odrębnych skupisk genetycznych, odpowiadających Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus. W obu przypadkach, wszystkie osobniki z Waszyngtonu, D.C. grupowały się razem z Cx. p. pipiens z innych lokalizacji. Wartości Fst dla par genomowych były wysoce istotne dla wszystkich porównań (ryc. 5). Nie zidentyfikowaliśmy żadnego specyficznego regionu o wysokiej dywergencji w genomie (Ryc. 6). Ogólnie, wartości Fst były znacznie wyższe między Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens niż między autogenicznymi i anautogenicznymi próbkami Cx. p. pipiens z Waszyngtonu, D.C. Najbardziej zróżnicowaną grupą, na podstawie wszystkich przeprowadzonych analiz, był szczep Cx. p. molestus z Chicago, IL, co można wytłumaczyć bardzo niską różnorodnością genetyczną tego szczepu spowodowaną jego długotrwałą kolonizacją i możliwym wąskim gardłem, które przyspieszyło dryf genetyczny (ryc. 7).

Podobne obserwacje o niezależnym monofiletycznym pochodzeniu Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens uzyskano stosując analizę mikrosatelitarną w ~600 próbkach komarów Cx. p. pipiens pochodzących z różnych lokalizacji na świecie19. Procedura nieukorzenionego drzewa odległości grupowała osobno nadziemne populacje Cx. p. pipiens i podziemne populacje Cx. p. molestus z północnej i południowej Europy. Podobnie jak w naszych badaniach, nadziemne populacje Cx. p. pipiens z USA tworzyły dodatkowe skupisko sugerujące bardziej intensywną hybrydyzację pomiędzy członkami kompleksu Cx. pipiens w Ameryce Północnej. Analiza domieszek wykazała obecność trzech głównych skupisk, które odpowiadały Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens i Cx. quinquefasciatus. To ostatnie skupisko stwierdzono w tym badaniu tylko w próbkach z USA. W innej pracy opartej na analizie polimorfizmu długości fragmentów amplifikowanych (AFLP) porównano próbki z południowej i północnej Europy oraz szczepy z Chicago, IL, USA24. Populacje północnoamerykańskie i europejskie wykorzystane w tym badaniu wykazywały podobny wzór ADMIXTURE w skanowaniu genomu AFLP. Analiza genów COI również wskazała na monofiletyczne pochodzenie Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus w Europie, Azji i Afryce26.

Więc niezależne monofiletyczne pochodzenie i wysoki poziom rozbieżności genetycznej między Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens sugerują, że ci dwaj członkowie kompleksu Cx. pipiens reprezentują odrębne jednostki filogenetyczne z niezależnymi historiami ewolucyjnymi przed translokacją dokonaną przez człowieka.

Koncepcje specjacji i ewolucji kompleksu Clex pipiens

Teoretyczne modele specjacji u zwierząt można podzielić na dwie główne grupy: specjację allopatryczną lub geograficzną oraz specjację sympatryczną lub ekologiczną. Pierwsza koncepcja specjacji, intensywnie propagowana przez E. Mayra3 , sugeruje, że początkowe taksony są najpierw izolowane geograficznie. Taka sytuacja ogranicza przepływ genów między populacjami i może prowadzić do akumulacji mutacji powodujących niezgodność genetyczną mieszańców. Alternatywna koncepcja specjacji kładzie nacisk na bariery ekologiczne pomiędzy powstającymi taksonami jako główne czynniki ewolucji31. Scenariusz ten zakłada rozwój izolacji reprodukcyjnej między populacjami w wyniku adaptacji do różnych środowisk bez izolacji geograficznej, co zwykle ma miejsce w obliczu przepływu genów. W tej sytuacji mieszańce między początkowymi taksonami stają się mniej dopasowane do środowiska, co sprzyja naturalnej selekcji wszelkich cech ograniczających kojarzenie między nimi. Uważamy, że ogólna dywersyfikacja podgatunków Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus stanowi uderzający przykład specjacji poprzez mechanizmy izolacji przez ekologię. W naszych badaniach analiza Fst wykazała znaczny poziom dywersyfikacji genomowej między Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus (ryc. 5 i 6) w całym genomie, bez wyraźnych wysp specjacji. Zaskakująco, poziom zróżnicowania był niższy wokół centromerów, prawdopodobnie z powodu małej liczby wiarygodnych SNV w tych wysoce powtarzalnych regionach. Zróżnicowanie było bardzo wysokie pomiędzy szczepami Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus z Chicago, IL, USA, ale było niższe pomiędzy podgatunkami w kolekcjach komarów euroazjatyckich. Ogólnie rzecz biorąc, obserwacje te sugerują znaczne ograniczenie przepływu genów między podgatunkami.

Opisano kilka mechanizmów izolacji reprodukcyjnej między Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus17. Dwa z nich mają charakter działania prezygotycznego, przed zapłodnieniem, i ograniczają możliwości kojarzenia się komarów. Pierwszy mechanizm związany jest ze specjalizacją siedliskową larw: Cx. p. molestus zajmuje piwnice lub inne podziemne środowiska, podczas gdy Cx. p. pipiens preferuje otwarte, nadziemne zbiorniki wodne jako miejsca rozrodu. Zmniejsza to szanse obu podgatunków na spotkanie i połączenie się w pary w stadium dorosłym. Drugi mechanizm izolacyjny opiera się na różnicach w zachowaniu godowym między Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens. Samce Cx. p. molestus zwykle tworzą jednorodne roje przy ziemi i wymagają ograniczonej przestrzeni do odbycia godów17. Z kolei samce Cx. p. pipiens roją się w pobliżu liści, około 2-3 m nad ziemią. Eksperymentalne badania zachowań godowych w małych klatkach wykazały, że w krzyżówkach samic i samców Cx. p. molestus sukces kopulacyjny wynosił 90%, natomiast u Cx. p. pipiens tylko 3,3%32. W krzyżówkach międzygatunkowych pomiędzy Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens sukces kopulacyjny był również niski i wahał się od 6,6% do 10% w zależności od płci podgatunków. Badania te wykazały, że samice obu podgatunków aktywnie unikają kopulacji z samcami z alternatywnego podgatunku. Ponadto samicom Cx. p. pipiens nie udawało się przyjąć spermy od Cx. p. molestus i w rezultacie nie produkowały jaj.

Dwa inne mechanizmy izolacji reprodukcyjnej opisane dla Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus są postzygotyczne, działają po kopulacji i skutkują obniżoną kondycją mieszańców. Jeden z mechanizmów związany jest z dziedziczeniem diapauzy u mieszańców Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens jako cechy recesywnej8. Mieszańce F1 i znaczna część mieszańców F2 nie są zdolne do rozwinięcia diapauzy i nie mogą przetrwać w warunkach zimowych. Mechanizm ten być może wyjaśnia wyższy poziom introgresji u Cx. p. pipiens w południowych lokalizacjach19,23,24. Wreszcie, członkowie kompleksu Cx. pipiens narażeni są na niekompatybilność cytoplazmatyczną mieszańców zarażonych różnymi szczepami riketsji – pasożyta Wolbachia pipientis. Pomimo cytoplazmatycznej introgresji tego pasożyta poprzez hybrydyzację pomiędzy członkami kompleksu Cx. pipiens33 , niekompatybilność cytoplazmatyczna może znacząco ograniczyć przeżywalność mieszańców. Na przykład, zarażenie W. pipientis znacząco ograniczyło hybrydyzację pomiędzy Cx. pipiens i Cx. quinquefasciatus w Afryce Południowej34. W innym badaniu wykazano, że w populacjach euroazjatyckich Cx. p. molestus był zarażony tylko jednym szczepem W. pipientis, natomiast Cx. p. pipiens dwoma różnymi szczepami35. Co więcej, okazy Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens, które wykorzystaliśmy w naszych badaniach, były zarażone tymi samymi szczepami W. pipientis na południu Republiki Kirgiskiej, ale różnymi szczepami na północy Republiki Białorusi. Może to tłumaczyć różnice w introgresji z Cx. p. molestus do Cx. p. pipiens, która była bardziej wyraźna w Republice Białorusi niż w Republice Kirgiskiej. Interesujący przykład specjacji zakaźnej został opisany w południowoamerykańskim kompleksie Drosophila paulistorum. W tym kompleksie sześć półgatunków o pokrywającym się rozmieszczeniu geograficznym stało się reprodukcyjnie izolowanych w wyniku przed- i pokopulacyjnej izolacji wywołanej infekcją Wolbachiae36.

Ostatnie badania genomiczne przeprowadzone na różnych organizmach, w tym Drosophila simulans37, muszkach owocowych Rhagoletis38,39 i motylach Heliconius40,41 dostarczają dodatkowych dowodów na to, że specjacja ekologiczna występuje w przyrodzie. Genomowe wzorce specjacji mogą być bardzo różne2, od małych wysp genomowych specjacji40 do znacznych poziomów dywergencji w całym genomie. Szeroko rozpowszechniona dywergencja genomowa została zidentyfikowana pomiędzy początkowymi gatunkami Anopheles gambiae i An. coluzzii w kompleksie An. gambiae42. Gatunki te były początkowo identyfikowane na podstawie różnic w strukturze ich rybosomalnego DNA jako formy S i M43, ale później ich status taksonomiczny został podniesiony do poziomu gatunku44. Uważa się, że An. gambiae i An. coluzzii rozwijają bariery reprodukcyjne w symbiozie, co wynika z różnic w ich preferencjach ekologicznych45. Stadium larwalne An. gambiae związane jest z małymi basenami deszczowymi. Z kolei An. coluzzi wykorzystuje stałe zbiorniki wodne związane z uprawą ryżu. Mimo że bariery prezygotyczne między tymi gatunkami są niekompletne46, wykształciły one różnice w zachowaniu podczas rojenia47,48 i rozbieżne rodzaje pieśni49.

Więc, wysoki poziom dywergencji w całym genomie, uderzająca różnica w przystosowaniu do odmiennych środowisk ekologicznych i dowody na istnienie prezygotycznych i postzygotycznych barier w kojarzeniu sugerują, że Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus reprezentują odrębne jednostki ekologiczne, które podlegają początkowej specjacji ekologicznej.

Hybrydyzacja w kompleksie Culex pipiens

Najbardziej intrygującą obserwacją dotyczącą członków kompleksu Cx. pipiens jest to, że pomimo różnic w ekologii, fizjologii, zachowaniu i rozmieszczeniu geograficznym, nadal mogą się oni hybrydyzować i wytwarzać zdolne do życia potomstwo w naturze, co wskazuje, że izolacja reprodukcyjna między nimi nie jest całkowita. Nasze badania wykazały również znaczące przypadki hybrydyzacji między podgatunkami Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens. Porównanie całych genomów wykazało, że większość próbek Cx. p. pipiens reprezentuje osobniki z pewnym poziomem introgresji z Cx. p. molestus (Rys. 4). Zaobserwowaliśmy dużą rozbieżność między filogenezą jądrową i mitochondrialną (ryc. 2, 8), co wskazuje, że historycznie między podgatunkami może dochodzić do transmisji genomów mitochondrialnych. Jednocześnie nie zaobserwowaliśmy haplogrup wspólnych dla lokalnych populacji podgatunków. Na kontynentach wszystkie filogenezy mitochondrialne były silnie monofiletyczne, co wskazuje na męską dyspersję i hybrydyzację. Domieszka z Cx. p. molestus była wyższa w południowych populacjach Cx. p. pipiens w Republice Kirgiskiej i w Waszyngtonie, D.C., USA, ale niższa w północnych populacjach w Republice Białorusi i Chicago, IL, USA. Może to być związane z niezdolnością mieszańców do rozwoju diapauzy w zimnym klimacie. Dla porównania, analiza mikrosatelitarna wykazała skromny poziom hybrydyzacji między Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus wynoszący ~8% w północnych miastach USA (Chicago, IL i Nowy Jork, NY)30,50. W południowej Europie, gdzie Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus występowały w postaci naziemnej, poziom hybrydyzacji między nimi był podobny i szacowany na 8-10%51. Znacznie wyższy poziom hybrydyzacji stwierdzono w populacjach południowych we wschodnich Stanach Zjednoczonych, gdzie ~40% wszystkich próbek zidentyfikowano jako hybrydy między Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens19. Tak więc, ogólne wskaźniki hybrydyzacji między członkami Cx. pipiens były wyższe w Ameryce Północnej niż w Starym Świecie. Dla porównania, hybrydyzacja między kryptycznymi gatunkami w kompleksie An. gambiae (An. gambiae i An. coluzzi) znacząco wahała się od 1% w Mali46 do >20% w Gwinei Bissau52, co jest porównywalne z ogólnymi poziomami hybrydyzacji między Cx. p. molestus i Cx. p. pipiens.

Interesujące jest to, że w naszym badaniu nie stwierdziliśmy sygnatury domieszki Cx. p. pipiens w żadnej próbce Cx. p. molestus z Republiki Białorusi, Republiki Kirgiskiej i Chicago, IL, USA (ryc. 4). Wyniki te wskazują na bardzo ograniczony lub żaden przepływ genów z Cx. p. pipiens do Cx. p. molestus. Podobne wnioski dotyczące asymetrycznej introgresji z Cx. p. molestus do Cx. p. pipiens wykazały wcześniejsze badania20,51. Mechanizm asymetrycznej introgresji nie jest obecnie znany. Jedna z hipotez sugeruje, że samce Cx. p. molestus, które mogą kopulować w ograniczonych przestrzeniach, mogą hybrydyzować zarówno z samicami Cx. p. molestus, jak i Cx. p. pipiens. W przeciwieństwie do tego, Cx. p. pipiens, które wymagają przestrzeni do rojenia się, mają większą skłonność do kojarzenia się z samicami Cx. p. pipiens51. Jednak do wyjaśnienia tego zjawiska potrzebne są dalsze populacyjne badania genetyczne i eksperymentalne.

Wreszcie, nasze badania wykazały, że Cx. p. pipiens może rozwijać autogenezę w wyniku adaptacyjnej introgresji materiału genetycznego z Cx. p. molestus. W terenie zebraliśmy próbki z nadziemnych i podziemnych środowisk w Waszyngtonie, D.C., USA, wybraliśmy komary do autogenezy. Komary podziemne były autogeniczne, ale komary nadziemne były anautogeniczne. Jednakże, komary zarówno z kolonii autogenicznych jak i anautogenicznych tworzyły pojedyncze skupisko, gdy zastosowano analizę łączenia sąsiadów (Rys. 2). Ponadto, metody PCA (Rys. 3) i ADMIXTURE (Rys. 4) połączyły te próbki razem z Cx. p. pipiens z innych lokalizacji. Populacje o mieszanej charakterystyce znaleziono w Europie51 i w USA53. W Portugalii u Cx. p. molestus znaleziono również nietypowy wzór zachowań związanych z odżywianiem się krwią ptaków54.

Więc obecność trwającej hybrydyzacji między członkami kompleksu Cx. pipiens sugeruje, że proces specjacji między nimi nie jest zakończony, a postzygotyczne bariery izolacji reprodukcyjnej nie są w pełni ukształtowane. Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że członkowie kompleksu Cx. pipiens stanowią doskonały model do badania różnych aspektów specjacji geograficznej i ekologicznej w obliczu trwającego między nimi przepływu genów i lokalnych adaptacji do zróżnicowanych środowisk.

.