Znaczenie pomp efflux w antybiotykooporności bakterii

Pompy efflux są białkami transportowymi zaangażowanymi w wyciskanie toksycznych substratów (w tym praktycznie wszystkich klas antybiotyków istotnych klinicznie) z wnętrza komórek do środowiska zewnętrznego. Białka te występują zarówno u bakterii Gram-dodatnich i ujemnych, jak i u organizmów eukariotycznych.1 Pompy mogą być specyficzne dla jednego substratu lub mogą transportować szereg odmiennych strukturalnie związków (w tym antybiotyki wielu klas); takie pompy mogą być związane z opornością wielolekową (MDR). W królestwie prokariotycznym wyróżnia się pięć głównych rodzin transporterów efflux:2 MF (major facilitator), MATE (multidrug and toxic efflux), RND (resistance-nodulation-division), SMR (small multidrug resistance) i ABC (ATP binding cassette). Wszystkie te systemy wykorzystują siłę motoryczną protonów jako źródło energii,3 z wyjątkiem rodziny ABC, która wykorzystuje hydrolizę ATP do napędzania eksportu substratów. Ostatnie postępy w technologii DNA i nadejście ery genomicznej doprowadziły do identyfikacji licznych nowych członków powyższych rodzin, a wszechobecność pomp efflux jest godna uwagi. Transportery, które wypierają wiele substratów, w tym antybiotyki, nie wyewoluowały w odpowiedzi na stresy ery antybiotykowej. Wszystkie badane genomy bakterii zawierają kilka różnych pomp efflux, co wskazuje na ich rodowód. Szacuje się, że ∼5-10% wszystkich genów bakteryjnych jest zaangażowanych w transport, a duża część z nich koduje pompy efflux.2,4

Istnieje pewna debata na temat „normalnej” fizjologicznej roli transporterów efflux, ponieważ zarówno bakterie wrażliwe na antybiotyki, jak i oporne są nosicielami i ekspresorami tych genów. W wielu przypadkach, geny pompy efflux są częścią operonu, z genem regulacyjnym kontrolującym ekspresję. Zwiększona ekspresja jest związana z opornością na substraty, np. oporność na sole żółci i niektóre antybiotyki u Escherichia coli jest spowodowana nadekspresją akrAB.5 Chociaż geny kodujące pompy efflux można znaleźć na plazmidach, to jednak przeniesienie genów pomp efflux na chromosom daje bakterii wewnętrzny mechanizm umożliwiający przetrwanie w nieprzyjaznym środowisku (np. w obecności antybiotyków), a więc zmutowane bakterie, które wykazują nadekspresję genów pomp efflux, mogą być selekcjonowane bez pozyskiwania nowego materiału genetycznego. Jest prawdopodobne, że pompy te powstały po to, aby szkodliwe substancje mogły być transportowane poza bakterię, umożliwiając jej przetrwanie. Rzeczywiście, obecnie powszechnie przyjmuje się, że „wewnętrzna oporność” bakterii Gram-ujemnych na niektóre antybiotyki w porównaniu z bakteriami Gram-dodatnimi jest wynikiem aktywności systemów efflux.6 Systemy efflux, które przyczyniają się do oporności na antybiotyki zostały opisane u wielu ważnych klinicznie bakterii, w tym Campylobacter jejuni (CmeABC7,8), E. coli (AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, EmrB, EmrD9), Pseudomonas aeruginosa (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN i MexXY-OprM9), Streptococcus pneumoniae (PmrA10), Salmonella typhimurium (AcrB11) i Staphylococcus aureus (NorA12). Wszystkie te systemy wypierają fluorochinolony, a pompy RND (CmeB, AcrB i pompy Mex) również eksportują wiele antybiotyków.

Nadekspresja pomp wypierających może być wynikiem mutacji w obrębie lokalnych genów represorowych13-15 lub może wynikać z aktywacji regulonu regulowanego przez globalny regulator transkrypcji, taki jak MarA lub SoxS z E. coli.16,17 Szeroki zakres substratów systemów efflux jest niepokojący, ponieważ często nadekspresja pompy powoduje oporność na antybiotyki więcej niż jednej klasy, jak również na niektóre barwniki, detergenty i środki dezynfekujące (w tym niektóre powszechnie stosowane biocydy). Problemem jest również oporność krzyżowa; ekspozycja na jakikolwiek czynnik, który należy do profilu substratów pompy, będzie sprzyjać nadmiernej ekspresji tej pompy i w konsekwencji oporności krzyżowej na wszystkie inne substraty pompy. Mogą to być między innymi istotne klinicznie antybiotyki. Przykładem tego jest ponownie system mexAB P. aeruginosa; mutanty, które nadmiernie produkują MexAB są mniej wrażliwe, jeśli nie całkowicie oporne na szereg antybiotyków (fluorochinolony, β-laktamy, chloramfenikol i trimetoprim), ale także na triklosan, powszechnie stosowany w gospodarstwie domowym środek biobójczy.18 Potencjalne nadużywanie biocydów i możliwa selekcja bakterii opornych krzyżowo na antybiotyki były ostatnio przedmiotem debaty w tym czasopiśmie i w innych miejscach.19-22 Nadekspresja samej pompy efflux oporności wielolekowej często nie nadaje wysokiego poziomu, klinicznie istotnej oporności na antybiotyki. Jednak takie bakterie są lepiej wyposażone, aby przetrwać presję antybiotyków i rozwijać dalsze mutacje w genach kodujących miejsca docelowe antybiotyków.23 Wykazano, że szczepy E. coli oporne na fluorochinolony są 1000-krotnie łatwiej selekcjonowane z mutantów mar niż bakterie typu dzikiego,24 a wysoce oporne na fluorochinolony E. coli zawierają mutacje w genach kodujących docelowe enzymy topoizomerazy oraz mają zmniejszoną akumulację i zwiększony odpływ (obniżenie regulacji porin i nadekspresja pompy odpływowej).14,15 Additive increases in MICs of antibiotics have also been seen after concurrent over-expression of more than one pump of different classes, also resulting in highly resistant E. coli.25

Wykazano, że ekspresja systemów Mex u P. aeruginosa i systemu efflux akrAB u E. coli jest największa, gdy bakterie są poddane stresowi, np. wzrost w pożywce ubogiej w składniki odżywcze, wzrost do fazy stacjonarnej lub szok osmotyczny; te niegościnne warunki mogą być istotne dla sytuacji w zakażeniu.26,27 Nieregulowana nadekspresja pomp efflux jest potencjalnie niekorzystna dla bakterii, ponieważ nie tylko toksyczne substraty będą eksportowane, ale również składniki odżywcze i półprodukty metaboliczne mogą zostać utracone. Praca z P. aeruginosa sugeruje, że mutanty wykazujące nadmierną ekspresję pomp Mex są mniej odporne na stres środowiskowy i mniej zjadliwe niż ich odpowiedniki typu dzikiego.28 W rezultacie ekspresja pomp jest ściśle kontrolowana. Jednakże mutanty i izolaty kliniczne, które wykazują nadmierną ekspresję pomp efflux są stabilne i powszechnie izolowane; być może takie mutanty gromadzą mutacje kompensacyjne pozwalające im rosnąć tak dobrze jak bakterie typu dzikiego.

Ostatnio badano wykorzystanie inhibitorów pomp efflux w celu poprawy i wzmocnienia aktywności eksportowanych antybiotyków. Taka strategia została wykorzystana do opracowania inhibitorów, które zmniejszają wpływ pomp effluksowych na aktywność fluorochinolonów. Ponieważ wiele pomp efflux wykazuje znaczną homologię strukturalną, istnieje nadzieja, że jeden związek inhibitorowy będzie aktywny wobec wielu pomp pochodzących z różnych gatunków bakterii. Większość badań koncentrowała się na pompach effluksowych Mex P. aeruginosa i ich inhibitorach. Jeden z takich inhibitorów obniżał wartości MIC fluorochinolonów zarówno dla szczepów wrażliwych, jak i opornych.2 Ponadto częstość selekcji szczepów opornych na fluorochinolony była również niższa w obecności inhibitora, co sugeruje, że efflux może być istotny w selekcji oporności na fluorochinolony. Podobne obserwacje poczyniono dla S. pneumoniae i S. aureus.29,30 Opisano również wymóg nienaruszonego systemu efflux, aby umożliwić rozwój mutacji topoizomerazy i w konsekwencji oporności na fluorochinolony u E. coli.31 Związek między aktywnym effluxem a mutacjami w genach kodujących białka miejsca docelowego sugeruje, że stosowanie takich inhibitorów, w połączeniu z antybiotykami substratowymi, może być użyteczne poprzez zwiększenie zarówno aktywności, jak i zakresu gatunków, dla których lek może być skuteczny. Projektowanie nowych leków i modyfikacja istniejących cząsteczek powinny być obecnie prowadzone z uwzględnieniem pomp efflux. Zmiany strukturalne, które zmniejszają zdolność antybiotyku do wypływu bez zmniejszania jego aktywności mogą prowadzić do rozwoju silniejszych związków, z pewnością „wypływalność” leków musi być teraz brana pod uwagę, ponieważ środki są opracowywane w odniesieniu do ich ogólnej skuteczności i prawdopodobieństwa rozwoju oporności.

Podsumowując, istnieje coraz więcej dowodów na to, że rola pomp wypływowych w oporności na antybiotyki u bakterii jest znacząca. Chociaż oporność na wysokim poziomie może nie występować wyłącznie w wyniku działania pomp effluksowych MDR, nie można ignorować związku nadmiernej ekspresji tych genów wśród wysoce opornych izolatów klinicznych. Wrodzona oporność niektórych gatunków na antybiotyki może być również w dużej mierze spowodowana przez pompy efflux. Selekcja mutantów efflux przez biocydy spotykane w środowisku jest potencjalnym problemem; potrzebne są dalsze prace w celu ilościowego określenia ryzyka, jeżeli takie istnieje, wynikającego z takiego procesu. Synergiczny wzrost oporności obserwowany przy nadmiernej ekspresji systemu(ów) efflux, jak również mutacje w miejscu docelowym mogą prowadzić do wysoce opornych bakterii, które są trudne do leczenia. Efekt działania pomp efflux musi być brany pod uwagę przy projektowaniu przyszłych antybiotyków, a rola inhibitorów oceniana w celu zmaksymalizowania skuteczności obecnych i przyszłych antybiotyków.

Dla zainteresowanych, istnieje wiele doskonałych artykułów przeglądowych skupiających się na pompach efflux.2,3,9,11,32,33

.