Węzeł Hollidaya

Dwa szlaki rekombinacji homologicznej u eukariotów, pokazujące powstawanie i rozwiązywanie węzłów Hollidaya

Połączenie Hollidaya jest kluczowym pośrednikiem w rekombinacji homologicznej, procesie biologicznym, który zwiększa różnorodność genetyczną poprzez przenoszenie genów między dwoma chromosomami, jak również w rekombinacji specyficznej dla miejsca z udziałem integraz. Są one również zaangażowane w naprawę pęknięć podwójnej nici. Ponadto, struktury krzyżowe obejmuj±ce j±dra Hollidaya mog± powstawać w celu odci±żenia naprężeń helikalnych w symetrycznych sekwencjach w superkolejkach DNA. Podczas gdy czteroramienne połączenia pojawiają się również w funkcjonalnych cząsteczkach RNA, takich jak U1 spliceosomalnego RNA i rybozymu szpilki do włosów wirusa pierścieniowej plamistości tytoniu, te zazwyczaj zawierają niesparowane nukleotydy pomiędzy sparowanymi domenami podwójnie helikalnymi, a zatem nie przyjmują ściśle struktury Hollidaya.

Jazdy Hollidaya w rekombinacji homologicznej są pomiędzy identycznymi lub prawie identycznymi sekwencjami, co prowadzi do symetrycznego układu sekwencji wokół centralnego połączenia. Pozwala to na wyst±pienie procesu migracji gałęzi, w którym nici przesuwaj± się przez punkt poł±czenia. Rozszczepienie, lub rozwiązanie, złącza Hollidaya może nastąpić na dwa sposoby. Rozszczepienie pierwotnego zestawu nici prowadzi do powstania dwóch cząsteczek, które mogą wykazywać konwersję genów, ale nie krzyżowanie chromosomalne, natomiast rozszczepienie drugiego zestawu dwóch nici powoduje, że powstałe cząsteczki rekombinantów wykazują krzyżowanie. Wszystkie produkty, niezależnie od rozszczepienia, są heterodupleksami w regionie migracji złącza Hollidaya.

Wiele białek jest w stanie rozpoznać lub zniekształcić strukturę złącza Hollidaya. Jedna z takich klas zawiera enzymy rozwiązujące połączenia, które rozszczepiają połączenia, czasami w sposób specyficzny dla sekwencji. Białka te zniekształcają strukturę złącza na różne sposoby, często ciągnąc złącze w konformację nieułożoną, rozbijając centralne pary zasad i/lub zmieniając kąty między czterema ramionami. Inne klasy to białka migracji rozgałęzień, które zwiększają szybkość wymiany o rzędy wielkości, oraz rekombinaz specyficznych dla danego miejsca. U prokariotów, resolwenty Holliday’a dzielą się na dwie rodziny, integrazy i nukleazy, z których każda jest strukturalnie podobna, chociaż ich sekwencje nie są konserwowane.

W eukariotach, dwa podstawowe modele naprawy przerwania podwójnej nici DNA przez rekombinację homologiczną to ścieżka naprawy przerwania podwójnej nici (DSBR) (czasami nazywana modelem podwójnego złącza Holliday’a) oraz ścieżka SDSA (synthesis-dependent strand annealing). W przypadku przerwania podwójnej nici, koniec 3′ ulega degradacji, a dłuższy koniec 5′ wdziera się do sąsiadującej chromatydy siostrzanej, tworząc pęcherzyk replikacyjny. Gdy pęcherzyk ten zbliża się do uszkodzonego DNA, dłuższa 5′ nić antysensowna ponownie wdziera się do nici sensu tej części DNA, transkrybując drugą kopię. Kiedy replikacja się kończy, oba ogony są ponownie łączone, tworząc dwa złącza Hollidaya, które są następnie rozszczepiane w różnych wzorach przez białka. Animację tego procesu można zobaczyć tutaj.

Połamania dwuniciowego DNA u bakterii są naprawiane przez ścieżkę RecBCD rekombinacji homologicznej. Przerwy, które występują tylko na jednej z dwóch nici DNA, znane jako luki jednoniciowe, są naprawiane przez ścieżkę RecF. Zarówno szlaki RecBCD jak i RecF obejmują serię reakcji znanych jako migracja gałęzi, w której pojedyncze nici DNA są wymieniane pomiędzy dwoma skrzyżowanymi cząsteczkami dupleksowego DNA, oraz rozdzielanie, w którym te dwie skrzyżowane cząsteczki DNA są rozcinane i przywracane do normalnego dwuniciowego stanu. Rekombinacja homologiczna występuje w kilku grupach wirusów. W wirusach DNA, takich jak herpeswirusy, rekombinacja zachodzi poprzez mechanizm break-and-rejoin, podobnie jak u bakterii i eukariontów. U bakterii migracja rozgałęzień jest ułatwiona przez kompleks RuvABC lub białko RecG, silniki molekularne, które wykorzystują energię hydrolizy ATP do przemieszczania połączenia. Złącze musi następnie zostać rozdzielone na dwa oddzielne dupleksy, przywracając konfigurację rodzicielską lub krzyżową. Rozdzielenie może zachodzić w sposób poziomy lub pionowy podczas rekombinacji homologicznej, dając produkty typu patch (jeśli są w tej samej orientacji podczas naprawy przerwania podwójnej nici) lub produkty typu splice (jeśli są w różnych orientacjach podczas naprawy przerwania podwójnej nici). RuvA i RuvB są białkami migracji gałęzi, podczas gdy RuvC jest enzymem rozwiązującym połączenia.

Istnieją dowody na rekombinację w niektórych wirusach RNA, szczególnie w wirusach ssRNA o pozytywnym sensie, takich jak retrowirusy, pikornawirusy i koronawirusy. Istnieją kontrowersje co do tego, czy rekombinacja homologiczna występuje w wirusach ssRNA o ujemnym sensie, takich jak grypa.

RozdzielczośćEdit

W drożdżach pączkujących Saccharomyces cerevisiae, połączenia Hollidaya mogą być rozwiązywane przez cztery różne ścieżki, które odpowiadają za zasadniczo wszystkie rozwiązania połączeń Hollidaya in vivo. Ścieżka, która wytwarza większość krzyżowań w drożdżach pączkujących S. cerevisiae i prawdopodobnie u ssaków, obejmuje białka EXO1, heterodimer MLH1-MLH3 (zwany MutL gamma) i SGS1 (ortolog helikazy zespołu Blooma). Heterodimer MLH1-MLH3 wiąże się preferencyjnie z połączeniami Hollidaya. Jest to endonukleaza, która dokonuje przerwania pojedynczej nici w superskręconym dwuniciowym DNA. Heterodimer MLH1-MLH3 sprzyja powstawaniu rekombinantów krzyżowych. Podczas gdy pozostałe trzy szlaki, w które zaangażowane są odpowiednio białka MUS81-MMS4, SLX1 i YEN1, mogą promować rozwiązywanie połączeń Hollidaya in vivo, brak wszystkich trzech nukleaz ma jedynie niewielki wpływ na powstawanie produktów krzyżowania.

Podwójne mutanty pozbawione zarówno MLH3 (główna ścieżka) jak i MMS4 (mniejsza ścieżka) wykazały dramatycznie zmniejszone crossing over w porównaniu do typu dzikiego (od 6 do 17 razy); jednakże żywotność zarodników była dość wysoka (62%), a rozłączenie chromosomalne wydawało się w większości funkcjonalne.

Ale MUS81 jest składnikiem pomniejszego szlaku crossing-over w mejozie drożdży pączkujących, roślin i kręgowców, u pierwotniaka Tetrahymena thermophila, MUS81 wydaje się być częścią istotnego, jeśli nie dominującego szlaku crossing-over. Ścieżka MUS81 również wydaje się być dominującą ścieżką krzyżowania w drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe.

Białka MSH4 i MSH5 tworzą heteroligomeryczną strukturę (heterodimer) u drożdży i ludzi. W drożdżach Saccharomyces cerevisiae MSH4 i MSH5 działają specyficznie w celu ułatwienia krzyżowania pomiędzy chromosomami homologicznymi podczas mejozy. Kompleks MSH4/MSH5 wiąże i stabilizuje podwójne węzły Holliday’a oraz sprzyja ich rozwiązaniu w produkty krzyżowania. Hipomorficzny (częściowo funkcjonalny) mutant MSH4 u S. cerevisiae wykazał 30% redukcję liczby krzyżowań w całym genomie oraz dużą liczbę mejoz z chromosomami niewymiennymi. Niemniej jednak, mutant ten dał początek wzorcom żywotności zarodników sugerującym, że segregacja niewymiennych chromosomów zachodziła wydajnie. Tak więc w S. cerevisiae prawidłowa segregacja najwyraźniej nie zależy całkowicie od krzyżówek między parami homologicznymi.