Articles /

U.S. Food and Drug Administration

Podręcznik analityki bakteriologicznej (BAM) Strona główna

Autorzy: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett and Jennifer M. Hait

Historia rewizji:

  • Czerwiec 2017 – Dodano nowy rozdział 13B do Bacteriological Analytical Manual
  • Styczeń 2018 – Poprawiono hiperłącze dla CDC APHIS/CDC Form 4

Staphylococcal food poisoning (SFP) jest zatruciem wynikającym ze spożycia żywności zanieczyszczonej odpowiednim poziomem wstępnie uformowanych enterotoksyn. Objawy SFP pojawiają się w ciągu 2-8 godzin od spożycia i obejmują nudności, wymioty, skurcze brzucha z lub bez biegunki, które zazwyczaj ustępują w ciągu 24-48 godzin. (Argudin et al., 2010). Liczba osób dotkniętych SFP jest jedynie szacunkowa ze względu na błędną diagnozę i niewielkie ogniska, które nie są zgłaszane. Hospitalizacja jest rzadka, ale została odnotowana u osób z obniżoną odpornością, szczególnie u osób starszych i bardzo młodych (Scallan et al., 2011).

Staphylococci są normalnie obecne na ludzkiej skórze i błonach śluzowych z około 20-30% w przypadku trwałej i 60% w przypadku przerywanej kolonizacji (Kluytmans et al., 2005). Pracownicy zajmujący się żywnością, którzy są skolonizowani enterotoksycznymi gronkowcami są uważani za główne źródło skażenia żywności poprzez bezpośredni kontakt z produktami lub powierzchniami kontaktowymi. Zwierzęta, takie jak bydło mleczne, również mogą być nosicielami gronkowców i mogą stanowić źródło zanieczyszczenia mleka i produktów mlecznych. Wreszcie, gronkowce obecne w środowisku mogą być przenoszone na produkty spożywcze, stanowiąc potencjalne źródło skażenia (Gutiérrez et al., 2012).

Żywność powszechnie związana z SFP obejmuje żywność przetworzoną, mięso, drób, nabiał i wyroby piekarnicze. Po zanieczyszczeniu żywności może dojść do wzrostu gronkowców i produkcji enterotoksyn, zwłaszcza jeśli nie są przestrzegane dobre warunki produkcji, które zapobiegają wzrostowi, takie jak przechowywanie w warunkach chłodniczych lub etapy zabijania cieplnego, takie jak pasteryzacja (Gutiérrez et al., 2012). Enterotoksyny gronkowcowe są stabilne termicznie i nie ulegają denaturacji, chyba że są wystawione na działanie wysokich temperatur przez długi czas, tj, autoklawowanie w temperaturze 121°C (250°F) przy ciśnieniu 15 PSI przez 60 minut (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus jest najczęściej powiązany z epidemiami zatruć pokarmowych wywołanych przez gronkowce, ale inne enterotoksyczne gronkowce koagulazo-dodatnie, takie jak S. hyicus i S. intermedius, również zostały powiązane z epidemiami (Hennekinne et al., 2010). Enterotoksyny gronkowcowe (SEs) są pirogennymi egzotoksynami o aktywności superantygenowej. Enterotoksyny są białkami globularnymi, odpornymi na działanie ciepła i proteaz, o wielkości cząsteczki średnio około 25 kDa. Szacunki dotyczące ilości toksyny potrzebnej do wywołania choroby są bardzo niskie. W jednym ognisku związanym z mlekiem czekoladowym wykryto poziom SEA na poziomie 0,5ng/ml (Evenson et al., 1988), a 0,38ng/ml SEA wykryto w ognisku związanym z mlekiem w proszku (Asao, et al., 2003).

Klasyczne SE (SEA-SEE) i nieklasyczne SE, SEG, SEH, SEI, SER i SET mają udowodnioną aktywność emetyczną. Aktywność emetyczna dla enterotoksyn SElJ-SElQ, SElS, SElU i SElV nie została jeszcze wykazana. Wszystkie geny se i sel zostały zlokalizowane na ruchomych elementach genetycznych, w tym na bakteriofagach, wyspach patogenności, plazmidach lub transpozonach (Argudin i in., 2012).

Wykrywanie SE ma zasadnicze znaczenie dla bezpieczeństwa żywności i ochrony jej dostaw. Metody wykrywania SE opierają się na dostępnych w handlu poliwalentnych testach immunologicznych ELISA (enzyme-linked immunoassay) lub EFLA (enzyme-linked fluorescent immunoassay) z przeciwciałami, które wykrywają SEA-SEE. Metody monowalentne są specyficzne dla SEA-SEE i mogą być stosowane do rozróżniania tych typów. Metody te wymagają ekstrakcji enterotoksyny z podejrzanej żywności przed analizą. Czułość i selektywność metody zwiększa się po zagęszczeniu ekstraktu żywności metodą dializy, ale ograniczenia czasowe mogą wymagać przeprowadzenia wstępnych badań bez zagęszczania. Jednakże, stężenie dializacyjne powinno być wykonane na wszystkich produktach mlecznych przed analizą (Hennekinne et al., 2012).

UWAGA: Enterotoksyny gronkowcowe są wysoce toksyczne i procedury, które mogą tworzyć aerozole powinny być wykonywane w zatwierdzonych szafach bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Enterotoksyny gronkowcowe (SEA, SEB, SEC, SED i SEE) są czynnikami selektywnymi. Naukowcy muszą przestrzegać wytycznych ustanowionych przez CDC: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Sprzęt i materiały specjalne
    1. Pomieszczenie z kontrolowaną temperaturą lub lodówka 2-8°C.
    2. Blender lub homogenizator.
    3. Inkubator 35-37°C.
    4. Waga analityczna i łódki wagowe.
    5. Taca do dializy.
    6. pH-metr. Ważne jest pH podczas ekstrakcji i pH buforów stosowanych w ekstrakcji. Dokonać korekty w zakresie ± 0,1 jednostki pH.
    7. Wirówka chłodzona 2-8°C.
    8. Oczynia laboratoryjne szklane lub polipropylenowe, aby uniknąć adsorpcji toksyn.
    9. Tkanina filtracyjna jest używana do zbierania resztek po wirowaniu. Często do wykonania tego zadania używa się kilku warstw wstępnie zwilżonej, grubej serwety.
    10. Lejek sekcyjny.
    11. Membrana dializacyjna MWCO 6,000-8,000 daltonów (np. Spectra/Por® z zamknięciami) o płaskiej szerokości 23 ± 2 mm.
    12. Próżniowe urządzenia do filtracji w probówkach stożkowych (membrana 0,22µm), takie jak Steriflip (EMD Millipore) zalecane do filtrowania supernatantów hodowli płynnych jako środek bezpieczeństwa w celu uniknięcia aerozolizacji enterotoksyn.
    13. Szafka bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Odczynniki

    Uwaga: producenci zestawów mogą wymagać innych buforów lub rozpuszczalników.

    1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (roztwór PBS) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) w celu przygotowania 1L PBS rozpuścić 9 g NaCl i 3,58 g Na2HPO4 w 1L wody destylowanej. Dostosować pH do 7,2 ± 0,2 przy użyciu HCl.
    2. Chlorek sodu (NaCl).
    3. Fosforan sodu (Na2HPO4).
    4. Glikol polietylenowy (PEG) (20 000 mol mas.) Przygotować 30% (w/v) roztwór PEG przez dodanie 30 g PEG na każde 70 ml wody destylowanej.
    5. 1 N (lub 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (lub 0,1 N) HCl.
  3. Przygotowanie błony dializacyjnej
    Przyciąć błonę dializacyjną wystarczająco długą, aby pomieścić ekstrakt żywności, który ma być zatężony. Namoczyć rurki w 2 zmianach wody destylowanej, aby usunąć powłokę glicerynową. Używając zamknięcia membranowego lub zawiąż jeden koniec rurki na 2 węzły blisko siebie. Napełnić rurkę wodą destylowaną i sprawdzić szczelność, ściskając napełniony worek, trzymając otwarty koniec szczelnie zamknięty. Opróżnić worek i umieścić go w wodzie destylowanej do czasu użycia.
  4. Ekstrakcja enterotoksyny z porcji żywności

    UWAGA: ta procedura i inne procedury, które mogą generować aerozole patogennych mikroorganizmów lub enterotoksyn, powinny być wykonywane w zatwierdzonej szafce bezpieczeństwa biologicznego.

    1. Jeśli to możliwe, zmielić cały produkt żywnościowy lub porcje z reprezentatywnych wybranych produktów w mikserze w celu ujednorodnienia próbki, tak aby każdy SE obecny w żywności był równomiernie rozprowadzony.
      1. Dla serów ze skórką, pobierz próbkę sera z 10% skórki i 90% sera.
      2. Dla produktów suszonych, użyj równych ilości wody z produktem do zmieszania lub postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Odważ 25 g próbki w szklanej zlewce i przenieś badaną porcję do blendera z 40 ml wody destylowanej i mieszaj z dużą prędkością przez 3 minuty generując zhomogenizowaną zawiesinę. Nie dodawać wody do próbek płynnych, lecz przejść do etapu 3.
    3. Pozwolić toksynie na dyfuzję poprzez wytrząsanie próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    4. Zakwasić mieszaninę 0,1N HCl do pH pomiędzy 3,5 a 4,0. Uwaga: jeżeli pH spadnie poniżej 3,0, należy przygotować kolejną porcję 25 g.
    5. Zakwaszoną zawiesinę przenieść do stożkowych probówek propylenowych o pojemności 50 ml. Wirować przy 3 130 × g przez 20 min. w 5°C. Można stosować niższe prędkości i dłuższy czas wirowania, ale oczyszczanie niektórych rodzajów żywności nie jest tak skuteczne. Oddzielenie materiałów tłuszczowych jest nieskuteczne, chyba że żywność jest odwirowywana w temperaturze chłodzenia.
    6. Odcedź płyn supernatantu do zlewki o pojemności 800 ml przez szmatę serową lub inny odpowiedni materiał filtracyjny umieszczony w lejku rozdzielającym. Jeżeli supernatant nie jest klarowny, odwirować ponownie i zdekantować płyn przez płótno serowarskie. Zbadać pH, które powinno wynosić między 3,5 a 4,5. Jeżeli pH jest prawidłowe, zneutralizować mieszaninę 0.1N NaOH, aby uzyskać pH pomiędzy 7.4 i 7.6.
    7. Jeżeli pH wynosi >4.5 powtórzyć zakwaszanie, ale jeżeli <3.0 lub=””>9.0 powtórzyć proces z kolejną 25 g porcją żywności.
    8. Pod warunkiem, że dostępna jest wystarczająca ilość próbki do powtórnego badania, można pobrać jej część do badania przesiewowego przy użyciu zwalidowanego testu (patrz sekcja H). Jeżeli wyniki badań przesiewowych są negatywne, pozostały ekstrakt należy zagęścić za pomocą dializy i ponownie zbadać.
  5. Dializacyjne zagęszczanie ekstraktu
    1. Umieścić ekstrakt w przygotowanym woreczku do dializy. Położyć zamknięty worek na tacy i zanurzyć worek w 30% (w/v) PEG. Trzymać w temperaturze 5°C, aż objętość zmniejszy się do 15-20 ml lub mniej. Proces ten może trwać 24-72 godziny, ale jeśli objętość nie zmniejszy się po przetrzymaniu przez noc, należy dodać sproszkowany PEG do tacki. Wyjąć woreczek z PEG i umyć go dokładnie wodą, aby usunąć PEG przylegający do woreczka. Namoczyć w wodzie destylowanej przez 1-2 minuty. Przelać zawartość do małej zlewki.
    2. Wypłukać wnętrze worka 2-3 ml wody destylowanej (PBS jest używany do mleka i produktów mlecznych), przesuwając palcami w górę i w dół po zewnętrznej stronie worka, aby usunąć materiał przylegający do ścianek rurki. Powtarzać płukanie aż do uzyskania przejrzystego płynu. Utrzymywać objętość tak małą, jak to możliwe.
    3. Dostosować pH ekstraktu do 7,4-7,6.
    4. Skoncentrowane ekstrakty powinny być analizowane w ciągu 48 godzin i przechowywane w temperaturze 3-5°C, w przeciwnym razie należy zamrozić ekstrakty w temperaturze 18-20°C i całkowicie rozmrozić w temperaturze 3-5°C przed badaniem. Niektóre testy, takie jak Vidas SET2 wymagają natychmiastowej analizy.
  6. Testowanie SE z kultur bakteryjnych

    Szczepy gronkowców podejrzane o wytwarzanie enterotoksyn mogą być wstępnie wzbogacone w bulionie odżywczym, takim jak TSB lub BHI.

    1. Przeniesienie dwóch lub trzech morfologicznie podobnych kolonii do 10 mL bulionu odżywczego.
    2. Inkubować 35-37°C przez noc na wytrząsarce orbitalnej.
    3. Wirować hodowle 5 minut 3500 × g w 10°C
    4. Filtrować supernatant przy użyciu urządzenia do filtracji próżniowej Steri-Flip z filtrem 0,22µm lub innego systemu zamkniętego w celu uniknięcia aerozolizacji enterotoksyn. Ta procedura musi być wykonywana w szafie bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić bezpieczeństwo naukowca.
    5. Supernatanty hodowlane mogą mieć wysokie poziomy SE, które są poza zakresem liniowym zestawu, mogą wymagać rozcieńczenia za pomocą PBS.
  7. Raportowanie wyników

    Obecność enterotoksyny gronkowcowej wykrytej w produktach spożywczych należy zgłosić do Federalnego Programu Czynników Selektywnych zarządzanego przez Centrum Kontroli i Ochrony przed Chorobami (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.html poprzez wypełnienie formularza 4 APHIS/CDC Form 4.

    Wyniki dodatnie zgłasza się jako Staphylococcal entertoxoin detected in × g (ml) of product. Wyniki negatywne są podawane jako enterotoksyna gronkowcowa niewykryta w × g (ml) produktu.

  8. Uwagi

    Zestaw musi być w stanie wykryć enterotoksynę na minimalnym poziomie 0,05ng/g z wysokim poziomem względnej czułości (>90%) i względnej specyficzności (>90%).

    Wskazanie nazw handlowych lub produktów komercyjnych w metodzie służy wyłącznie celom informacji naukowej i nie oznacza rekomendacji lub poparcia przez U. S. Food and Drug Administration. Dwie metody, które są powszechnie stosowane do wykrywania SE, obejmują zatwierdzoną przez AOAC metodę Vidas SET2 (bioMerieux, Inc), która jest zautomatyzowanym, poliwalentnym testem fluorescencyjnym sprzężonym z enzymem (EFLA), wykrywającym SEA-SEE (Oficjalna metoda AOAC 2007.06 VIDAS SET2 do wykrywania enterotoksyny gronkowcowej w wybranych produktach spożywczych, Final Action, 2010). Aktualny numer katalogowy dla Vidas Set2 to Ref. 30705. Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) jest ręcznym testem immunologicznym sprzężonym z enzymami, wykonywanym w studzienkach pokrytych poliwalentnymi przeciwciałami. Poliwalentny zestaw Ridascreen wykrywa enterotoksyny gronkowcowe SEA-SEE i został zwalidowany i zweryfikowany poprzez próby pierścieniowe oraz badania walidacyjne stron trzecich prowadzone przez Laboratorium Referencyjne Unii Europejskiej dla gronkowców koagulazo-dodatnich dla mandatu Europejskiego Komitetu Normalizacyjnego (CEN) proponującego normę ISO 19020. Dostępny jest zestaw monowalentny Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG), ale ten zestaw nie został zwalidowany przez stronę trzecią. Numer katalogowy dla zestawu poliwalentnego Set Total to R4105 (96 testów) lub R4106 (48 testów) . Numer katalogowy dla zestawu monowalentnego SET A,B,C,D,E to R4101.

Interferencje

Reakcje nieswoiste mogą wystąpić w produktach spożywczych zawierających enzymy endogenne, takie jak laktoperoksydaza lub fosfataza alkaliczna i zakłócać działanie zestawów takich jak Vidas SET2, który wykorzystuje fosfatazę alkaliczną jako enzym wykrywający (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Zaleca się, aby wszystkie wyniki pozytywne były potwierdzane za pomocą alternatywnej metody, która wykorzystuje inny enzym wykrywający. W przypadku Vidas SET2 jedną z alternatywnych metod jest Ridascreen SET Total, który wykorzystuje laktoperoksydazę.

Obróbkę cieplną można zastosować w celu usunięcia endogennej fosfatazy alkalicznej z próbki w następujący sposób:

  • Przeniesienie 600 μL stężonego ekstraktu do probówki
  • Ogrzewanie w temperaturze 80°C przez 2 minuty
  • Powtórzenie badania Vidas SET2 z ochłodzonym koncentratem. Może wystąpić pewna utrata enterotoksyny.

Jeśli podejrzewa się, że wynik jest niedokładny przy użyciu zestawu Ridascreen lub innego zestawu wykorzystującego laktoperoksydazę, przenieść 100 μL stężonego ekstraktu do probówki. Dodać po 50μL roztworów substratu i zestawu chromagenowego. Wymieszać i obserwować, czy pojawi się niebiesko-zielony kolor. Jeżeli pojawi się niebieskozielone zabarwienie, oznacza to, że w próbce obecna jest laktoperoksydaza, która zakłóca wynik oznaczenia. Dlatego należy zastosować inną metodę wykrywania.

  1. Argudin, MA, Mendoza, MC, and Rodicio MR. Food Poisoning and Staphylococcus aureus Enterotoxins. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
  2. Argudin, MA, Mendoza, MC, Gonzáalez-Hevia, MA, Bances, M, Guerra, B, and Rodicio MR. Genotypes, Exotoxin Gene Content, and Antimicrobial Resistance of Staphylococcus aureus Strains Recovered from Foods and Food Hanglers. AEM 2012 78 2930-2935.
  3. Asao, T, Kumeda, Y, Kawai, T, Shibata, T, Oda, H, Nakazawa, H, and Lozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimate of entertoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol. Infect., 2003, 130, 33-40.
  4. Centers for Disease Control/National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Fifth Edition, 2007, Evenson, ML, Hinds, MW, Bernstein, RS, Befgdoll, MS. Oszacowanie ludzkiej dawki gronkowcowej enterotoksyny A z dużego ogniska gronkowcowego zatrucia pokarmowego związanego z mlekiem czekoladowym. Int J Food Microbiol 1988, 31, 311-316.
  5. Gutiérrez, D, Delgado, S, Vázquez-Sánchez, D, Martinez, B, Caba, ML, Rodriguez, A, Herrera, JJ, and Garcia, P. Incidence of Staphylococcus aureus and Analysis of Associated Bacterial Communities on Food Industry Surfaces. AEM 2012, 78, 8547-8554.
  6. Hennekinne, JA, Ostyn, A, Fuillier, F, Hervin, S, Prufer, AL, and Dragacci, S. How Should Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks be Characterized? Toxins, 2010, 2, 2106-2116.
  7. Hennekinne, JA, De Buyser, MA, and Dragacci, S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 2012, 36, 815-836.
  8. Kluytmans, JAJW, and Wertheim, HFL. Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection 2005, 33, 3-8.
  9. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 2011 Jan. http://www.cdc.gov/EID/content/17/1/7.htm
  10. Vernozy-Rozand, C., Mazuy-Cruchaudet, C., Bavai, C. and Richard, Y. (2004), Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food. Lett App Microbiol, 2004, 39, 490-494 . doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01602.x

.

Leave a Reply