The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy

DNA barcoding jest nowym systemem zaprojektowanym w celu zapewnienia szybkiej, dokładnej i automatycznej identyfikacji gatunków poprzez wykorzystanie krótkich, standaryzowanych regionów genów jako wewnętrznych znaczników gatunków. W konsekwencji sprawi, że system taksonomiczny Linneusza będzie bardziej dostępny, co przyniesie korzyści ekologom, konserwatorom i różnorodnym agencjom odpowiedzialnym za kontrolę szkodników, gatunków inwazyjnych i bezpieczeństwa żywności. W szerszym ujęciu, kodowanie paskowe DNA pozwala wyobrazić sobie dzień, w którym każdy dociekliwy umysł, od zawodowych biologów po dzieci w wieku szkolnym, będzie miał łatwy dostęp do nazw i atrybutów biologicznych każdego gatunku na naszej planecie. Poza przypisywaniem okazów do znanych gatunków, barcode DNA przyspieszy tempo odkrywania gatunków, pozwalając taksonomom na szybkie sortowanie okazów i wskazując rozbieżne taksony, które mogą reprezentować nowe gatunki. Poprzez rozszerzenie swoich możliwości w ten sposób, DNA barcoding oferuje taksonomom możliwość znacznego rozszerzenia, a ostatecznie ukończenia, globalnego spisu różnorodności życia.

Pomimo potencjalnych korzyści płynących z DNA barcoding zarówno dla praktyków, jak i użytkowników taksonomii, było ono kontrowersyjne w niektórych kręgach naukowych (Wheeler, 2004; Will i Rubinoff, 2004; Ebach i Holdredge, 2005; Will et al., 2005). Niektórzy nawet scharakteryzowali DNA barcoding jako „antytaksonomię”, twierdząc, że jego wdrożenie będzie sygnałem śmierci systemu, który powstawał 250 lat. Uważamy, że sprzeciw ten wynika z błędnych przekonań na temat barcodingu DNA. W związku z tym z zadowoleniem przyjmujemy tę możliwość wyjaśnienia zarówno przesłanek, jak i potencjalnych skutków stosowania barkodingu DNA. Odpowiadając na ten zestaw pytań, podkreślamy wielorakie pozytywne skutki tego podejścia dla taksonomii i nauki o bioróżnorodności.

Pytania

Mając dwa miliardy dolarów amerykańskich (szacowany koszt kompleksowego programu barcodingu DNA), jak wydalibyście te pieniądze z korzyścią dla badań taksonomicznych i bioróżnorodności, i jakie byłoby dziedzictwo tych danych?

To pytanie ignoruje nieuchronną rzeczywistość; nie ma perspektyw na pojedynczą infuzję 2 miliardów dolarów wsparcia dla jakiegokolwiek programu badań nad bioróżnorodnością. Taki poziom inwestycji może w końcu zostać osiągnięty, ale jeśli tak, to będzie on odzwierciedlał rozłożony w czasie i geograficznie rozproszony proces pozytywnych decyzji finansowych, które będą w dużej mierze zależały zarówno od postępu naukowego, jak i społecznego zapotrzebowania na identyfikacje na poziomie gatunków. Niewielkie środki finansowe przeznaczone do tej pory na barcoding DNA przyniosły obfity plon w postaci odkryć naukowych. Fakt ten skłonił nowe organizacje do zapewnienia wsparcia niezbędnego do zbadania skalowalności tych wyników w całym królestwie zwierząt. Wczesne i pozytywne wyniki tej drugiej fali badań zmotywowały większe grupy badawcze do zjednoczenia się. W rzeczywistości, pierwsze sojusze o globalnym zasięgu zostały stworzone w celu prowadzenia prac nad bibliotekami sekwencji kodów kreskowych dla wszystkich ptaków i ryb. Segmenty znacznie bardziej bogatych gatunkowo grup, takich jak rośliny i lepidoptera, znajdują się na wcześniejszych etapach tego procesu (www.barcoding.si.edu). Te grupy badawcze mogą, w dłuższej perspektywie, tworzyć jednostki jądrowe potrzebne do tego, by inicjatywa kodów kreskowych przeszła do dziedziny „wielkiej nauki”, gdzie sukces zależy od połączenia jasno określonego, społecznie znaczącego programu badawczego z silnymi międzynarodowymi sojuszami badawczymi.

Należy również zauważyć, że dążenie do uzyskania wsparcia na dużą skalę dla kodowania kreskowego DNA nie odbywa się kosztem finansowania taksonomicznego. W istocie, jest oczywiste, że każda udana kampania mająca na celu wygenerowanie tego wsparcia spowoduje znaczny dopływ środków finansowych dla instytucji i osób zaangażowanych w badania taksonomiczne. Ogólnie rzecz biorąc, koszty związane z sekwencjonowaniem DNA będą stanowiły niewielki składnik wysiłków związanych z barcodingiem DNA; większość funduszy zostanie przeznaczona na globalne wysiłki związane z gromadzeniem okazów, na opiekę nad nimi oraz na rozwój internetowych baz danych zawierających szczegółowe informacje na ich temat. Co więcej, należy podkreślić, że fundusze już pozyskane pochodzą od dużych fundacji i agencji rządowych oraz programów, które nie mają tradycji wspierania badań taksonomicznych, a w niektórych przypadkach wnioski dotyczące barcodingu DNA konkurowały bezpośrednio z projektami medycznymi i genomiki porównawczej, a nie z projektami związanymi z badaniami taksonomicznymi. Patrząc z tej perspektywy, każdy zakrojony na szeroką skalę projekt barcode’u DNA będzie stanowił znaczące dobrodziejstwo, zarówno finansowe jak i naukowe, dla bioróżnorodności i badań taksonomicznych. Z pewnością pozostawi trwałą spuściznę w postaci kompleksowego, szeroko dostępnego systemu identyfikacji gatunków.

Globalnie, badania taksonomiczne alfa (odkrywanie i opisywanie nowych gatunków) przeżywają kryzys. Czy barcoding DNA jest dobrym rozwiązaniem tego problemu, czy też przyspieszy jego upadek?

Naszym zdaniem upadek taksonomii alfa nie jest konsekwencją rosnącego wykorzystania metod molekularnych, jak to czasem sugerowano (Wheeler, 2004). W rzeczywistości spodziewamy się, że barcoding DNA pomoże w odrodzeniu taksonomii. Programy barcodingu DNA z pewnością skierują nowe fundusze na zbieranie i katalogowanie okazów. Będą one również wspomagać badania taksonomiczne, pomagając w ujawnianiu gatunków kryptycznych (Hebert i in., 2004a, 2004b), łącząc płcie i stadia rozwojowe (Beskansky i in., 2003) oraz wyjaśniając problemy synonimii, które obecnie pochłaniają wiele wysiłku taksonomicznego (Alroy, 2002). Nowość i naukowa obietnica barcodingu DNA dodatkowo przyciągnie zainteresowanie opinii publicznej kwestiami taksonomii i bioróżnorodności, zachęcając młodych badaczy do podjęcia tej dyscypliny, a zarówno wydziały akademickie, jak i agencje zajmujące się zarządzaniem biomasą do ich zatrudniania.

Jesteśmy przekonani, że barcoding DNA będzie odgrywał coraz ważniejszą rolę jako taksonomiczne narzędzie przesiewowe ze względu na jego zdolność do szybkiego ujawniania nieciągłości genetycznych, które zwykle oddzielają odrębne gatunki (np. Janzen et al., 2005; Smith et al., 2005). Jego zastosowanie w ten sposób pozwoli na odwrócenie standardowych podejść taksonomicznych, które działają w sposób a priori – poszukując morfologicznych nieciągłości, które sygnalizują izolację reprodukcyjną wśród nieposortowanych skupisk organizmów. Z drugiej strony, kodowanie paskowe DNA pozwala na bardziej efektywne podejście a posteriori, w którym wcześniej zdefiniowane, genetycznie rozbieżne grupy są badane pod kątem zmienności cech. W tym sensie, kodowanie paskowe DNA będzie wyraźnie potężnym narzędziem taksonomii alfa.

Pokrywające się zróżnicowanie cech pomiędzy i wewnątrz gatunków jest dobrze udokumentowane dla wielu systemów cech. Dlaczego stanowi to mniejszy lub większy problem dla kodowania paskowego DNA?

Nakładanie się zmienności pojedynczych znaków nie stanowi problemu dla żadnego systemu taksonomicznego, czy to morfologicznego czy molekularnego, tak długo jak wiele znaków jest wykorzystywanych do diagnozowania taksonów. Jednym z powszechnych nieporozumień związanych z kodowaniem paskowym DNA jest to, że opiera się ono na pojedynczym znaku, a mianowicie „jednej sekwencji DNA”. W rzeczywistości, 648-bp region genu oksydazy cytochromu c podjednostki I (cox1 lub COI), używany jako standard kodu kreskowego DNA dla przedstawicieli królestwa zwierząt, stanowi złożony znak złożony z setek niezależnie różniących się komponentów. Niektóre z tych cech składowych są niezmienne i dlatego nie wszystkie 648 bp są informacyjne w obrębie danego zespołu taksonomicznego, ale większość jest zmienna. Na przykład, znaleźliśmy zmienność w 512 z 648 miejsc w dużym zestawie kodów kreskowych lepidoptera (9715 sekwencji z 2215 gatunków i 1047 rodzajów). Oznacza to, że nawet w obrębie jednego rzędu owadów, kody kreskowe DNA integrują wzorce podobieństw i różnic pomiędzy setkami cech. W pewnym sensie jest to jak wzorzec generowany przez łuski na skrzydle ćmy – każda łuska jest prawie bez znaczenia, ale złożona postać wzoru ubarwienia skrzydła jest wysoce informatywna.

Kod kreskowy DNA wykorzystujący region pojedynczego genu nie zapewnia pełnej rozdzielczości taksonomicznej, ale obiecuje bliskość. W oparciu o dotychczasowe wyniki dla różnych grup zwierząt, barcoding DNA zapewni rozdzielczość na poziomie gatunku w 95% do 97% przypadków (Hebert i in., 2004b; Janzen i in., 2005; Ward i in., 2005). Jeśli się nie uda, zawęzi opcje do małej liczby taksonów kongeneracyjnych (które, w wielu przypadkach, mogłyby być w pełni rozwiązane z dodatkowymi danymi genetycznymi lub innymi). Ta imponująca wydajność odzwierciedla dwie ważne i być może nieoczekiwane obserwacje: rzadkość dzielenia sekwencji mitochondrialnych między gatunkami oraz dużą ilość głębokich rozbieżności kodów kreskowych w obrębie gatunków. Ograniczona zmienność wewnątrzgatunkowa w różnych grupach zwierząt jest kluczowym odkryciem wczesnych prac nad kodami kreskowymi DNA, które zasługuje na głębsze badania naukowe. Mallet i Willmott, 2003), co może odzwierciedlać wpływ selekcji związanej z koewolucją genomu jądrowego i mitochondrialnego. Co ważne, w przypadku stosowania kodów kreskowych jako identyfikatorów na poziomie gatunku, różnice w kodach kreskowych wydają się szybko kumulować, umożliwiając odróżnienie wszystkich gatunków siostrzanych z wyjątkiem najmłodszych.

Uznajemy zarówno ogólną użyteczność danych genetycznych w badaniach taksonomicznych, jak i silną zgodność sygnałów taksonomicznych pochodzących z różnych genów. Podkreślamy jednak, że nie ma czegoś takiego jak „nieformalne kodowanie kreskowe DNA”. Kod paskowy DNA nie jest po prostu dowolną sekwencją DNA – jest to rygorystycznie standaryzowana sekwencja o minimalnej długości i jakości pochodząca z uzgodnionego genu, zdeponowana w głównej bazie danych sekwencji i dołączona do okazu, którego pochodzenie i aktualny status są rejestrowane. W rzeczywistości ustalono już, że tylko te sekwencje cox1, które spełniają te surowe kryteria, będą oznaczone jako kody kreskowe DNA przez GenBank National Center for Biotechnology Information (NCBI, GenBank; www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank), European Molecular Biology Laboratory (EMBL; www.embl.org), oraz DNA Data Bank of Japan (DDBJ; www.ddbj.nig.ac.jp).

Istnieje ważne rozróżnienie między „opisywaniem” a „wytyczaniem granic” gatunków, ale pomieszanie tych dwóch pojęć wywołało niepokój związany z wykorzystaniem kodów kreskowych DNA jako podstawy przyszłych opisów taksonomicznych. Podkreślamy, że kod kreskowy DNA ma na celu jedynie pomoc w wytyczaniu granic gatunków – wyróżnienie genetycznie odrębnych grup wykazujących poziom rozbieżności sekwencji sugerujący status gatunku. Z drugiej strony, kody kreskowe DNA – same w sobie – nigdy nie są wystarczające do opisania nowych gatunków. Na pewnym etapie, wyraźnie rozbieżne kody paskowe DNA, w połączeniu z innymi informacjami, zostaną wykorzystane jako podstawa do nadania nowej nazwy linneańskiej (Smith i in., 2005) i, jak w przypadku każdej hipotezy taksonomicznej, będzie ona podlegać ciągłej reewaluacji. Na przykład, w niedawnym badaniu ptaków Ameryki Północnej, próg dla wyznaczenia nowych prawdopodobnych gatunków został arbitralnie ustalony na poziomie 10 × średnia zmienność wewnątrzgatunkowa całego zestawu danych o kodach kreskowych. Doprowadziło to do odkrycia czterech przypuszczalnych nowych gatunków (Hebert i in., 2004b), ale decyzje dotyczące formalnego uznania tych taksonów pozostawiono, odpowiednio, społeczności ornitologicznej (zwłaszcza, że istniejące informacje morfologiczne i behawioralne potwierdzają te nowe hipotezy). Synergię między kodowaniem kreskowym DNA a badaniami różnorodności morfologicznej/ekologicznej ilustruje przypadek motyla z rodziny skoczkowatych, Astraptes fulgerator, u którego połączone podejście morfologiczne, historii naturalnej i kodowania kreskowego ujawniło zespół 10 gatunków na jednym małym obszarze Kostaryki. Co ważne, kilka z tych gatunków wykazywało stosunkowo niewielką dywergencję kodów kreskowych, ale połączenie tych informacji z zapisami dotyczącymi roślin żywicielskich larw i morfologii oświetliło pełną różnorodność tego kompleksu (Hebert i in., 2004a).

Zaproponowane geny kodowania kreskowego mogą nie być w stanie odtworzyć dokładnych drzew gatunków. Czy ma to znaczenie dla kodowania paskowego DNA?

Podkreślamy, że kody paskowe DNA nie mają na celu odtworzenia relacji filogenetycznych; dążą one raczej do identyfikacji znanych gatunków i pomocy w odkrywaniu nowych. Pomimo tego faktu, niektórzy przeciwnicy twierdzą, że kodowanie paskowe DNA zawodzi jako podejście taksonomiczne, ponieważ nie zawsze pozwala na odtworzenie dokładnych drzew gatunków (np. Will i Rubinoff, 2004). W tym kontekście ważne jest podkreślenie, że obecne umiejscowienia taksonomiczne należy traktować jako hipotezy, a nie fakty. Rozważmy podstawowy przykład zaproponowany przez Willa i Rubinoffa (2004) w ich krytyce kodowania paskowego DNA: mianowicie, że kody paskowe DNA sugerują bardzo bliskie pokrewieństwo między ćmą Simyra henrici a niektórymi gatunkami Acronicta (Hebert i in., 2003). Will i Rubinoff (2004:48) twierdzą, że takie umiejscowienie sprawia, że „niemożliwe jest odzyskanie jakichkolwiek informacji taksonomicznych poniżej poziomu ponadrodzajowego, nawet przynależności do rodzaju”. Jednakże, zamiast odzwierciedlać porażkę barcode’u DNA, wierzymy, że ten przypadek ilustruje siłę tego podejścia do naświetlania taksonomicznych przypisań, które wymagają kontroli. Tradycyjne przypisanie S. henrici do odrębnego rodzaju odzwierciedla fakt, że jego dorosłe osobniki mają bladożółte skrzydła przednie, wykazujące uderzającą rozbieżność z szaro-czarnymi skrzydłami przednimi gatunków Acronicta. Jednak morfologia larwalna, układ przednich skrzydeł u osobników dorosłych, nisza ekologiczna i anatomia narządów płciowych sugerują, że S. henrici jest blisko spokrewniona z Acronicta oblinata (D. Wagner, komunikacja osobista), a wniosek ten potwierdzają kody kreskowe DNA (ryc. 1). Jego charakterystyczne ubarwienie przednich skrzydeł prawdopodobnie odzwierciedla fakt, że larwy S. henrici żerują na trawach, w przeciwieństwie do żerujących na drzewach typowych gatunków Acronicta. Gwałtowna zmiana koloru skrzydeł została prawdopodobnie wymuszona przez dobór naturalny, aby ułatwić dopasowanie się do podłoża podczas dorosłego życia. Tak więc, ten szczególny przykład ujawnia nie tylko zdolność barcode’u DNA do udoskonalania istniejących hipotez taksonomicznych, ale także do dostarczania nowego wglądu w trajektorie ewolucyjne (patrz Janzen et al., 2005, dla innych przykładów dotyczących tropikalnych lepidopterans).

Niektóre gatunki nie są mitochondrialnie monofiletyczne, dzieląc polimorfizmy z taksonami niespokrewnionymi. Jak to wpłynie na identyfikacje przy użyciu metody kodowania kreskowego?

Ale chociaż teoretycznie może zachodzić pozioma wymiana mitochondriów między taksonomicznie rozbieżnymi organizmami, dowodów na to nie znaleziono wśród tysięcy gatunków zwierząt, które zostały już zakodowane kreskowo. Zaobserwowano wspólne sekwencje mitochondrialne (a więc i kody kreskowe), ale tylko wśród blisko spokrewnionych gatunków i przypuszczalnie w wyniku trwającej hybrydyzacji. Wpływ taksonomiczny takiego współdzielenia jest daleki od katastrofalnego – ogranicza identyfikacje do małego kompleksu kongenerów. Współdzielone kody kreskowe nie stanowią istotnego problemu taksonomicznego, ponieważ są rzadkie, a ich wpływ jest zaściankowy.

Warto podkreślić, że krytyczne testy współdzielenia sekwencji mitochondrialnej między gatunkami są trudne do przeprowadzenia. Wiele badań zakłada, że rozbieżności między identyfikacjami dokonanymi przy użyciu cech morfologicznych i kodów kreskowych DNA sygnalizują wady danych z kodów kreskowych. Przed krytycznym przyjęciem takich wniosków, konieczna jest silniejsza walidacja przyporządkowań opartych na morfologii. Na przykład, Wahlberg et al. (2003) donieśli o konfliktach między morfologią a różnicami w mitochondrialnym DNA u blisko spokrewnionego zespołu gatunków motyli, ale wniosek ten byłby znacznie mocniejszy, gdyby przyporządkowania morfologiczne zostały potwierdzone niezależnie przez kilku taksonomów (choć nadal mogłyby one odzwierciedlać błędną hipotezę taksonomiczną). Należy zauważyć, że przy kilku okazjach przeprowadzono ślepe testy kodowania kreskowego DNA. W istocie, barcoding DNA przeszedł podwójnie ślepą próbę, w której taksonom dostarczający okazy nie zdawał sobie sprawy z pełnej różnorodności gatunków obecnych w próbce (to znaczy, dopóki dalsze badania inspirowane wynikami barcodingu nie ujawniły kluczowych różnic biologicznych między nimi; np. Hebert i in., 2004a, 2004b). Dostarczenie empirycznej demonstracji, że kody kreskowe DNA są zdolne do spójnej, dokładnej i jednoznacznej identyfikacji jest kluczowym aspektem badań nad barcodingiem i tego samego należy oczekiwać od alternatywnych podejść.

Gdyby kiedykolwiek doszło do zakończenia programu kodowania kreskowego DNA, czy oznaczałoby to początek czy koniec badań taksonomicznych i bioróżnorodności, i jaka będzie rola systematyków w świecie, w którym większość identyfikacji odbywa się za pomocą „kodu kreskowego”?

Kodowanie kreskowe DNA zwiększy skalę i sukces nauki o bioróżnorodności poprzez znaczne zwiększenie dostępu do identyfikacji gatunków. Zautomatyzowany system oparty na DNA uwolni taksonomów od rutynowych identyfikacji, pozwalając im skierować swoje wysiłki na nowe kolekcje, opisy i ocenę relacji taksonomicznych. Niektórzy przeciwnicy barcode’u DNA twierdzą, że rutynowe identyfikacje są tylko niewielką częścią pracy taksonomów (Lipscomb i in., 2003; Wheeler, 2004; Will i Rubinoff, 2004), podczas gdy inni wychwalają potencjalną użyteczność zautomatyzowanych systemów identyfikacji, ale tylko jeśli opierają się na morfologii (Gaston i O’Neill, 2004; Wheeler, 2004). Uważamy, że identyfikacja gatunków jest krokiem ograniczającym dla wielu badań ekologicznych i bioróżnorodności, jak również dla badań taksonomicznych, i że w związku z tym kodowanie kreskowe DNA zarówno odciąży taksonomów, jak i wypełni bieżącą potrzebę z ważnymi korzyściami zarówno dla taksonomii, jak i nauki o bioróżnorodności.

W świecie kodów kreskowych, taksonomowie zachowają swoją wiodącą rolę w kojarzeniu, integracji i interpretacji wiedzy na temat zmienności stanów cech, które wyodrębniają gatunki i co to oznacza dla taksonomii wyższego poziomu. Jak już wcześniej wspomniano, ich praca nad nowymi zbiorowiskami życia może być często przyspieszona dzięki wykorzystaniu wyników badań nad kodami kreskowymi, co umożliwi podejście a posteriori do rozpoznawania gatunków. Taksonomowie będą oczywiście nadal wykorzystywać inne podejścia molekularne i morfologiczne do badania głębszych relacji taksonomicznych.

Czy nieunikniona ekspansja wysiłków w zakresie sekwencjonowania, która nastąpiłaby wraz z programem kodowania paskowego DNA, byłaby równoczesna ze spadkiem jakości badań taksonomicznych?

Sugerowano, że sekwencjonowanie jest zbyt drogie, trudne lub czasochłonne do przeprowadzenia przez taksonomów (np, Dunn, 2003; Mallet i Willmott, 2003; Seberg et al., 2003). Jednakże od poszczególnych taksonomów nie wymaga się wykonywania własnych sekwencjonowań, tak jak od poszczególnych fotografów nie wymaga się opracowywania własnych zdjęć. Barcoding przeszedł już do etapu „fotomatu”, gdzie dziesiątki tysięcy okazów są analizowane przy niskich kosztach w wysokonakładowych laboratoriach barcodingowych (np. na Uniwersytecie Guelph w Kanadzie i Smithsonian Institution w USA). Bezpośrednie „obciążenie” taksonomicznych współpracowników polega na zasilaniu pociągu analitycznego poprzez dostarczanie małych próbek tkanek ze zidentyfikowanych, potwierdzonych okazów, które mają być poddane kodowaniu kreskowemu. W miarę dojrzewania technologii mikrofluidycznych w następnej dekadzie, można spodziewać się rozwoju przystępnych cenowo, przyjaznych dla użytkownika, kompaktowych – jeśli nie podręcznych – urządzeń, które integrują wszystkie etapy od ekstrakcji DNA poprzez analizę sekwencji kodu kreskowego w celu uzyskania identyfikacji (ruch do etapu „Polaroid” w analogii do fotografii). Chociaż możemy się spodziewać, że takie instrumenty staną się standardowym wyposażeniem zarówno dla badań taksonomicznych, jak i dla szerszej społeczności organizacji i osób, które potrzebują szybkiego dostępu do identyfikacji gatunków, to z pewnością nie oznacza to, że barcoding zamieni taksonomów w biologów molekularnych.

Wierzymy, że narzędzia dostarczone przez barcoding DNA dodadzą rygoru do generowania i testowania hipotez taksonomicznych. Taksonomia jest generalnie wykonywana przy użyciu nieciągłości w analogowych (tj. stopniowanych morfologicznych) cechach do wnioskowania o granicach gatunków, podejście, które wygenerowało w sumie 1,7 miliona hipotez taksonomicznych w ciągu 250 lat. Barcoding DNA pozwala na testowanie tych hipotez przy użyciu niezależnego cyfrowego (tj. opartego na nukleotydach DNA) strumienia danych. Pomimo dobrej zgodności pomiędzy gatunkami rozpoznawanymi na podstawie metod morfologicznych a oznaczeniami opartymi na kodach kreskowych, zdarzają się rozbieżności. Takie przypadki powinny być mile widziane, gdyż wzmocnią zarówno hipotezy taksonomiczne, jak i metody analizy różnic w kodach kreskowych, a także mogą prowadzić do nowych odkryć w zakresie ewolucji i ekologii. Wszystkie te korzyści zostały udowodnione we wczesnych pracach nad kodami kreskowymi.

Zakładając, że problemy techniczne związane z kodowaniem kreskowym DNA mogą zostać przezwyciężone, czy obecnie, lub czy kiedykolwiek będzie to opłacalne w stosunku do tradycyjnych metod wykorzystania kodów kreskowych DNA do celów bioinwentaryzacji?

Główną zaletą i uzasadnieniem dla kodowania kreskowego DNA jest jego opłacalność w identyfikacji gatunków, zwłaszcza w ambitnych programach bioinwentaryzacji i biomonitoringu (Smith i in., 2005). W obecnej sytuacji, systemy produkcyjne do identyfikacji nawet niewielkiej grupy dokładnie poznanych gatunków na podstawie metod morfologicznych kosztują około 2 USD za okaz (np. programy monitoringu komarów, które dotyczą mniej niż 60 gatunków; F. C. Hunter, komunikacja osobista). Kiedy zespół specjalistów taksonomów zajmuje się większą grupą gatunków na określonym obszarze geograficznym, koszty znacznie wzrastają i identyfikacja pojedynczych osobników może kosztować 50-100 dolarów, jeśli wszystkie koszty są zinternalizowane. Obecnie, kod paskowy DNA może być wygenerowany za około 5 dolarów za okaz, wliczając w to koszty pracy i sekwencjonowania – i oczekuje się, że koszty te gwałtownie spadną. Z czasem, programy kodowania paskowego DNA mogą stać się samowystarczalne poprzez pobieranie niewielkich opłat za identyfikacje przy jednoczesnym zachowaniu otwartego dostępu dla badaczy akademickich.

Koszt jest tylko jednym z kryteriów oceny użyteczności systemu wsparcia taksonomicznego dla badań nad bioróżnorodnością. Szybkość, niezawodność i dostępność są równie ważne, a my wierzymy, że barcoding DNA wyróżnia się w tych dziedzinach. Dla kontrastu, nawet mniejsze programy biomonitoringu oparte na morfologii stoją obecnie przed poważnym wyzwaniem dostarczenia wyników w szybki i efektywny kosztowo sposób. Może to mieć dramatyczne konsekwencje ekonomiczne, jak w przypadku obecnych trudności z identyfikacją gatunków inwazyjnych na tyle wcześnie, by stłumić epidemię. Jednak korzyści ekonomiczne wynikające z wykluczenia nawet jednego szkodliwego najeźdźcy, takiego jak małż zebra z Ameryki Północnej, byłyby wystarczające po upływie dekady, aby zakodować większość gatunków zwierząt na Ziemi.

Zgadzamy się, że nauka oparta na hipotezach dominuje w konkursach na finansowanie na małą skalę i że taksonomia wypada słabo z powodu jej natury opartej na odkryciach. Z drugiej strony, każda inicjatywa „wielkiej nauki” – od fizyki subatomowej przez ludzki genom po eksplorację kosmosu – była oparta na odkryciach, i to będzie arena finansowania, na której będzie działał globalny program kodowania DNA, jeśli sprosta wyzwaniu. Podobnie jak w przypadku większości innych dużych projektów naukowych, barcoding DNA spotkał się z zarzutami, że „nie jest nauką” i że zagraża zdolności mniejszych laboratoriów do prowadzenia badań opartych na hipotezach. W poprzednich przypadkach takie twierdzenia zawsze okazywały się krótkowzroczne. Powtarzającym się spostrzeżeniem jest to, że nauka odkrywcza na dużą skalę snuje hipotezy w szalonym tempie i odkrywa drogi badań, których nigdy nie można było przewidzieć. W tym sensie wiele krytycznych uwag pod adresem barcodingu DNA jest niezwykle podobnych do tych, które dekadę temu dotyczyły projektu ludzkiego genomu.

Barcoding DNA już odniósł sukces w przyciąganiu znacznych funduszy od różnych agencji i organizacji, które nie były tradycyjnymi fundatorami taksonomii, ale nie zostało to osiągnięte poprzez sprzedaż „taksonomii” per se. Zamiast tego, inicjatywa barcodingu DNA promuje wizję szeroko dostępnego spisu różnorodności życia. Tylko poprzez podkreślenie korzyści dla społeczeństwa i wzbudzenie zainteresowania wśród podatników można uzyskać poparcie dla globalnej inicjatywy na rzecz bioróżnorodności. Oczywiście, nie oznacza to, że taksonomia ma stać się „zaawansowaną technologicznie branżą usługową” dla innych biologów, jak sugerują niektórzy (np. Lipscomb et al., 2003; Wheeler, 2004; Will i Rubinoff, 2004). Głównym celem kodowania paskowego DNA jest umożliwienie większości biologów niebędących taksonomami – a w rzeczywistości każdemu – bezpośredniego dostępu do informacji taksonomicznych, pozwalając jednocześnie zawodowym taksonom skupić się na generowaniu większej ilości takiej wiedzy.

Position Statement

Wysiłki zmierzające do inwentaryzacji różnorodności eukariotycznej poprzez analizy morfologiczne odniosły duży sukces. Wygenerowanie prawie dwóch milionów hipotez taksonomicznych w ciągu ostatnich 250 lat jest imponującym osiągnięciem, które zapewniło fundamentalne zrozumienie różnorodności biologicznej, ale wiele szczegółów czeka na wyjaśnienie. Barcoding DNA ma szansę pomóc w inwentaryzacji życia poprzez przyspieszenie odkrywania gatunków, testowanie aktualnych hipotez taksonomicznych oraz ułatwienie dostępu do identyfikacji gatunków. Wkład ten nie będzie dokonywany kosztem podstawowych wartości taksonomicznych lub finansowania. Barcoding DNA nie ma na celu porzucenia „badań morfologicznych na rzecz wąskiego i całkowicie molekularnego systemu identyfikacji” (Will i Rubinoff, 2004: 47). Dąży ono raczej do budowania sojuszy między taksonomami molekularnymi i morfologicznymi (Hebert i Barrett, 2005). Dąży również do zachowania linneańskich zasad, według których gatunki są nazywane i klasyfikowane. Kodowanie paskowe DNA wymaga istniejących, morfologicznych nazw gatunków do kalibracji, i to właśnie te nazwy są odzyskiwane, gdy kodowanie paskowe jest wykorzystywane do identyfikacji.

Jest ogólnie przyjęte, że badania nad bioróżnorodnością są poważnie niedofinansowane (Godfray, 2002). Nie jest łatwo przypisać to tematowi badań, ponieważ nauka o różnorodności biologicznej jest ważna i wzbudza duże zainteresowanie opinii publicznej. Ten obszar badań cierpi jednak z powodu kultury konfliktu. Zamiast nawiązywania wielkiej współpracy, społeczność zajmująca się bioróżnorodnością ma tradycję polaryzacji i walki. Barkodowanie DNA nie jest obce inwektywom – zostało nazwane „teoretycznie pustą technologią” i „sztuczką salonową” (Wheler, 2004; Will et al., 2005). Połączenie takich komentarzy z atakami ad hominem na zwolenników barcodingu DNA przynosi dyscyplinie niewiele uznania.

Niektórzy krytycy zarzucają, że podejście do barcodingu DNA jest fundamentalnie wadliwe, ale dostępne dane opowiadają zupełnie inną historię: sukces barcodingu DNA jest jak dotąd zdumiewająco imponujący. Jak zauważa Smith (2005), barcoding wypadł dobrze w teście przeprowadzonym na konferencji PEET. Co ważniejsze, w szeregu badań sprawdzono obecnie skuteczność barcode’u DNA w zespołach gatunków pochodzących z różnych obszarów geograficznych oraz z licznych grup taksonomicznych o zróżnicowanej historii życia i cechach ewolucyjnych. W konsekwencji tych testów wrażliwości, zapisy kodów kreskowych są obecnie dostępne dla ponad 13 000 gatunków zwierząt (i szybko się gromadzą) i ujawniają rozdzielczość, która nie jest złudzeniem (www.barcodinglife.org). W każdej grupie sukces w identyfikacji gatunków przekracza 95%, a nieliczne przypadki obniżonej rozdzielczości dotyczą niezdolności do rozróżnienia małej grupy blisko spokrewnionych gatunków (Hebert i in., 2004a, 2004b; Hebert i in., niepublikowane). Typowe wyniki przypominają te przedstawione na rycinie 1, na której pokazano wzór rozbieżności kodów kreskowych DNA dla 31 gatunków Acronicta, jednego z najbardziej zróżnicowanych rodzajów lepidoptera w Ameryce Północnej. W tym przypadku nie ma dowodów na współdzielenie sekwencji między taksonami, czego należałoby się spodziewać, gdyby dochodziło do hybrydyzacji lub gdyby gatunki były zbyt młode, by można je było rozróżnić. Zamiast tego mamy do czynienia z czystym rozdzieleniem gatunków ze spójnością kodów kreskowych dla kongenerów, nawet jeśli pochodzą one z różnych miejsc we wschodniej Ameryce Północnej.

Nie ma nic wyjątkowego w wynikach badań kodów kreskowych dla Acronicta-badania bezkręgowców glebowych z Arktyki i lepidopterów z tropików wykazują podobny sukces w rozdzielaniu gatunków (Hogg i Hebert, 2004; Janzen et al., 2005). Skuteczność ta rozciąga się również na środowisko morskie: badanie kodów kreskowych, w którym przebadano ponad 200 morfologicznie zdefiniowanych gatunków australijskich ryb, dało 100% sukces w ich rozróżnianiu (Ward et al., 2005). Testy wrażliwości na 10-krotny gradient tempa ewolucji mitochondriów wykazały wysoki sukces w identyfikacji gatunków z grup owadów o zarówno najniższym, jak i najwyższym tempie ewolucji (Ball et al., 2005; Smith et al., 2005). Zmiany w składzie nukleotydów genomu mitochondrialnego również nie mają wpływu na rozdzielczość kodowania paskowego DNA, co potwierdza sukces w grupach, takich jak ptaki, o wysokim składzie G+C i innych, takich jak pająki, o skrajnym odchyleniu A+T (Hebert i in., 2004b; Barrett i Hebert, 2005).

Jeśli te ostatnie badania odzwierciedlają ogólną wydajność kodów kreskowych w całym królestwie zwierząt, kompleksowy system oparty na Cox1 zapewni rozdzielczość taksonomiczną przekraczającą 99,99%, jeśli spojrzymy na to z perspektywy królestwa. Aby to zrozumieć, wystarczy wyobrazić sobie każdy z 10 000 dołków na Rysunku 2 jako repozytorium danych z kodów kreskowych jednego gatunku. Zakładając, że istnieje 10 milionów gatunków zwierząt, biblioteka kodów kreskowych dla tego królestwa mogłaby być reprezentowana przez zaledwie 1000 takich stron. Globalna awifauna, składająca się z około 10 000 gatunków ptaków, będzie zajmowała tylko jedną z tych stron. Kody kreskowe ryb świata zajmą trzy strony, a chrząszczy kilkaset. Po wypełnieniu wszystkich 10 milionów dołków danymi kodów kreskowych, analiza każdej nowej sekwencji kodu kreskowego zapewni natychmiastowy transport do właściwej strony z 1000, zapewniając rozdzielczość na poziomie 99,9%. W rzeczywistości, na podstawie danych dotyczących ptaków Ameryki Północnej, sekwencja kodu kreskowego zapewni doskonałą rozdzielczość, prowadząc do indywidualnego gatunku na stronie pojedynczego ptaka w 96% przypadków. W pozostałych przypadkach, nowo zebrany kod kreskowy będzie pasował do sekwencji w dwóch lub trzech sąsiednich dołkach. Podsumowując, krótki kod kreskowy zmniejszy niepewność co do tożsamości gatunkowej jednego z 10 milionów gatunków do pojedynczego gatunku w większości przypadków i do małego podzbioru blisko spokrewnionych gatunków w innych przypadkach.

Finansowanie jest obecnie zapewnione, aby zapewnić, że biblioteka kodów kreskowych DNA dla zwierząt wzrośnie o co najmniej 500 000 rekordów w ciągu najbliższych 5 lat, zapewniając pokrycie dla około 50 000 gatunków. Chociaż będzie to dalekie od kompletnego rejestru gatunków, pozwoli to na funkcjonowanie kodów kreskowych DNA jako skutecznego narzędzia identyfikacji dla tych grup taksonomicznych, które posiadają kompletne kody kreskowe. Na przykład, w miarę zbliżania się do ukończenia prac nad kodami kreskowymi dla ryb, ptaków i owadów szkodników, zapewni to otwarty dostęp do identyfikacji tych gatunków niezależnie od etapu życia lub stanu. W miarę jak do tego rdzenia rekordów gatunkowych będą dołączać kody kreskowe innych zwierząt, powstanie globalny system identyfikacji dla tego królestwa życia.

Pomimo, że wierzymy, iż ogólność kodów kreskowych została już zademonstrowana dla królestwa zwierząt, pozostaje potrzeba zarówno ustanowienia, jak i oceny protokołów kodów kreskowych dla innych królestw życia. Podstawowe zasady analizy kodów kreskowych (minimalizacja i standaryzacja sekwencji docelowych) z pewnością mają zastosowanie do tych organizmów, ale wybór regionów genowych i testowanie ich skuteczności jest nadal w toku, chociaż wczesne wyniki dotyczące roślin (Kress i in., 2005) i protistów (G.W. Saunders, komunikacja osobista) dają powody do optymizmu. Poza sukcesem w rozdzielaniu znanych gatunków, barcoding DNA będzie potężną pomocą w rozwiązywaniu innych problemów taksonomicznych. Regularnie ujawniane są gatunki przeoczone, nawet w dobrze zbadanych grupach, takich jak północnoamerykańskie ptaki (Hebert i in., 2004b), motyle (Hebert i in., 2004a) i jedwabniki (Janzen i in., 2005). Jego rola w kojarzeniu stadiów rozwojowych (Beskansky et al., 2003) i płci (Janzen et al., 2005), oraz w wyjaśnianiu synonimów, będzie również pomocna w wielu innych badaniach taksonomicznych.

Uruchomienie każdego większego programu naukowego wymaga nie tylko silnego uzasadnienia naukowego, ale wykazania znaczenia społecznego. Kodowanie paskowe DNA wykazuje takie znaczenie poprzez zapewnienie nowego dostępu do identyfikacji w różnych kontekstach. Wysiłki mające na celu ochronę życia są obecnie ograniczone przez potrzebę systemu identyfikacji i wierzymy, że potrzeba ta może być zaspokojona jedynie przez kodowanie kreskowe DNA (patrz również Smith et al., 2005). Zdolność kodów kreskowych do identyfikacji fragmentów życia ma szerokie zastosowanie, od rozwiązywania przypadków zastępowania gatunków na rynku (Marko i in., 2004) do ochrony bezpieczeństwa żywnościowego poprzez, na przykład, badanie pasz zwierzęcych na obecność odpadów pochodzących od przeżuwaczy. Mówiąc bardziej ogólnie, zdolność barkodowania DNA do szybkiego i taniego dostarczania identyfikacji ma potencjał zrewolucjonizowania relacji ludzkości z różnorodnością biologiczną (Janzen, 2004).

Jeśli barkodowanie DNA będzie prowadzone na dużą skalę, wygeneruje ono ważne produkty uboczne dla społeczności naukowej. Wszystkie ekstrakty DNA uzyskane podczas analizy kodów kreskowych z potwierdzonych okazów będą przechowywane, co pozwoli w przyszłości na zbadanie wzorców różnorodności sekwencji w innych regionach genowych, a programy zbierania zainicjowane przez kodowanie kreskowe DNA poszerzą liczbę okazów dostępnych do analizy morfologicznej. Inicjatywa dotycząca kodów kreskowych pozwoli również na stworzenie systemu opartego na sieci internetowej, który nie tylko umożliwi automatyczną identyfikację, ale również będzie stanowił portal z informacjami biologicznymi dotyczącymi wszystkich gatunków objętych rejestrem. Chociaż kodowanie paskowe DNA nie stworzy „encyklopedii życia”, wygeneruje jej indeks i spis treści.

Z powodu zarówno pozytywnych wyników naukowych, jak i uznanych korzyści społecznych, rośnie entuzjazm dla inicjatywy kodowania paskowego DNA na dużą skalę. Dwa spotkania w Cold Spring Harbor w 2003 roku wyjaśniły plany działania (Stoeckle, 2003), a kolejne spotkania miały miejsce. Ostatnie, zorganizowane przez Muzeum Historii Naturalnej w Londynie, zgromadziło ponad 230 badaczy (Marshall, 2005). Ruch na rzecz kodów kreskowych posiada również centralną siłę organizacyjną: Konsorcjum na rzecz Kodów Kreskowych Życia (Consortium for the Barcode of Life – CBOL), którego gospodarzem jest Smithsonian Institution w Waszyngtonie, a które rozpoczęło działalność w połowie 2004 roku. Do CBOL(www.barcoding.si.edu) przystąpiło już ponad 80 organizacji z 25 krajów, w tym wiele znaczących muzeów. Pod jego auspicjami uruchomiono pierwsze globalne kampanie kodów kreskowych; obejmują one plany zakodowania do 2010 roku wszystkich 10 000 gatunków ptaków i wszystkich 15 000 gatunków ryb morskich. Oczywiste jest, że aby sprostać tak poważnym projektom, prace muszą wykraczać poza pojedyncze laboratoria, dlatego też powstają krajowe sieci kodów kreskowych, których zadaniem jest stworzenie łańcuchów dostaw próbek oraz nadzorowanie podstawowych urządzeń analitycznych. Pierwsza z nich, Kanadyjska Sieć Kodów Kreskowych Życia (Canadian Barcode of Life Network), która rozpoczęła działalność w maju 2005 r. (www), zamierza w ciągu najbliższych 5 lat zakodować co najmniej 10 000 kanadyjskich gatunków zwierząt.

Postrzegamy te oznaki rosnącej synergii pomiędzy różnymi sektorami społeczności zajmującej się różnorodnością biologiczną jako niezwykle budzące nadzieję. Jeśli rozwinie się do pełnego potencjału, historia może postrzegać przedsięwzięcie barcodingu DNA jako takie, które nie tylko zwiększyło dostęp do informacji taksonomicznej, ale także wzmocniło sojusze pomiędzy wszystkimi zainteresowanymi dokumentacją, zrozumieniem i zachowaniem bioróżnorodności – co jest rzeczywiście ekscytującą perspektywą.

Podziękowania

Dziękujemy Markowi Stoeckle i Danowi Janzenowi za cenne sugestie dotyczące korekty wcześniejszych wersji tego artykułu. Jesteśmy również bardzo wdzięczni Fundacji Gordona i Betty Moore, NSERC, CFI i OIT za wsparcie badań nad barcodingiem DNA na Uniwersytecie w Guelph.

.