Overview of the Classical Histone Deacetylase Enzymes and Histone Deacetylase Inhibitors

Abstract

Ważna rola enzymów deacetylazy histonowej w regulacji ekspresji genów, proliferacji komórkowej i przeżycia sprawiła, że stały się one atrakcyjnym celem dla rozwoju inhibitorów deacetylazy histonowej jako leków przeciwnowotworowych. Kwas hydroksamowy suberojanilidu (Vorinostat, Zolinza), strukturalny analog prototypowej trichostatyny A, został zatwierdzony przez US Food and Drug Administration do leczenia zaawansowanego skórnego chłoniaka T-komórkowego w 2006 roku. Następnie w 2009 roku do leczenia tej samej choroby zatwierdzono cykliczny peptyd – depsipeptyd (Romidepsin, Istodax). Obecnie liczne inhibitory deacetylazy histonowej są w fazie badań przedklinicznych i klinicznych w leczeniu hematologicznych i litych nowotworów złośliwych. Większość z tych badań koncentruje się na kombinacji inhibitorów deacetylazy histonowej z innymi metodami leczenia, w szczególności z konwencjonalnymi chemioterapeutykami i radioterapią. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie przeglądu klasycznych enzymów deacetylazy histonowej oraz inhibitorów deacetylazy histonowej z naciskiem na potencjalne terapie skojarzone.

1. Wprowadzenie

Chromatyna jest dynamiczną strukturą, która poprzez liczne mechanizmy, w tym metylację DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów, ulega przebudowie w celu ułatwienia procesów metabolicznych, w tym transkrypcji, replikacji i naprawy. Jedną z dobrze zbadanych potranslacyjnych modyfikacji histonów jest acetylacja, która została po raz pierwszy zdefiniowana w latach 60-tych XX wieku. Acetylacja histonów jest kontrolowana przez przeciwstawne działania dwóch grup enzymów, mianowicie acetylotransferaz histonów (HAT) i deacetylaz histonów (HDAC). HAT katalizują przeniesienie cząsteczki acetylowej substratu acetylo-CoA na grupę ε-aminową reszt lizynowych na histonach. Powoduje to neutralizację dodatniego ładunku histonów, osłabiając ich oddziaływanie z ujemnie naładowanym DNA. Skutkuje to bardziej rozluźnioną, sprzyjającą transkrypcji konformacją chromatyny. Enzymy HDAC usuwają grupy acetylowe z histonów, co skutkuje bardziej skondensowanym, represyjnym transkrypcyjnie stanem chromatyny .

Zidentyfikowane do tej pory 18 enzymów HDAC ssaków dzieli się na dwie odrębne grupy. Enzymy HDAC klasy III, które obejmują sirtuiny 1-7, wymagają dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NAD+) do deacetylacji reszt lizyny. Zostały one powiązane z licznymi chorobami i procesem starzenia się. Pozostałe 11 enzymów jest zwykle znanych jako klasyczne enzymy HDAC i będą one przedmiotem zainteresowania w dalszej części tego artykułu. Po sklonowaniu i scharakteryzowaniu pierwszych ludzkich HDAC w latach 90-tych XX wieku, nastąpiło intensywne zainteresowanie funkcją i farmakologiczną manipulacją tych enzymów. Różne izoformy klasycznych enzymów HDAC zostały poddane rozległej analizie filogenetycznej i są pogrupowane w trzy różne klasy (Rycina 1). Enzymy klasy 1 składające się z HDAC1, 2, 3 i 8, które wykazują podobieństwo do drożdżowego regulatora transkrypcji RDP3, są zlokalizowane głównie w jądrze komórkowym. Ulegają one wszechobecnej ekspresji i pełnią ważne funkcje w regulacji proliferacji i przeżycia komórek. W przeciwieństwie do nich, enzymy HDAC klasy II, które wykazują homologię z drożdżowym Hda1, przemieszczają się między cytoplazmą a jądrem i mają bardziej ograniczone, specyficzne dla danej tkanki wzorce ekspresji i funkcje regulacyjne. Enzymy klasy II są dalej podzielone na klasę IIa (HDAC4, 5, 7 i 9; przemieszczają się między jądrem a cytoplazmą) i klasę IIb (HDAC6 i 10; głównie cytoplazmatyczne). Funkcje różnych izoform enzymów HDAC zostały ostatnio poddane przeglądowi. Szczególnie interesująca jest HDAC6, główna deacetylaza cytoplazmatyczna, która została stosunkowo dobrze scharakteryzowana, przynajmniej częściowo, dzięki pracy z tubacyną, specyficznym inhibitorem. Liczne cele białek niehistonowych dla HDAC6 zostały zidentyfikowane, w tym α-tubulina, kortaktyna, inne chaperony i peroksydoksyny. Ważna rola w proliferacji i przetrwaniu komórek sprawiła, że HDAC6 stała się ważnym celem terapii przeciwnowotworowej. Ostatnie odkrycia wskazują na połączone cytotoksyczne i apoptotyczne efekty specyficznego inhibitora HDAC6 tubacyny z konwencjonalnymi środkami chemioterapeutycznymi w komórkach nowotworowych, ale nie normalnych. Ponadto wykazano, że HDAC6 jest ważnym celem dla ochrony i regeneracji po urazie ośrodkowego układu nerwowego. HDAC11 jest jedynym członkiem klasy IV, który wykazuje podobieństwo zarówno do enzymów klasy I, jak i klasy II. Ostatnie dowody wskazują, że HDAC11 pełni role immunomodulacyjne .

Rycina 1

Zależności ewolucyjne pomiędzy klasycznymi enzymami deacetylaz histonowych (HDACs). Nadrodzina HDAC tworzy ewolucyjnie odrębne grupy w zależności od ich homologii sekwencji w stosunku do drożdży. Enzymy klasy I wykazuj± podobieństwo do drożdżowej, zredukowanej zależno¶ci potasowej-3 (Rpd3) i składaj± się z HDAC1, 2, 3 i 8. Rpd3 jest najbardziej homologiczny do HDAC1 i HDAC2. Klasa II HDAC wykazuje homologię do drożdżowej deacetylazy histonowej-1 (Hda1), a enzymy tej klasy tworzą dwie odrębne podklasy. Klasa IIa składa się z HDAC4, 5, 7 i 9; klasa IIb składa się z HDAC6 i 10. Hda1 jest najbliżej spokrewniony z HDAC6. Drzewo filogenetyczne pokazuje, że HDAC11 nie wykazuje wystarczającej homologii z HDAC klasy I lub II, więc tworzy klasę IV i wykazuje pewne podobieństwo zarówno do Rpd3, jak i Hda1. W nawiasach podano procent identyczności/podobieństwa sekwencji aminokwasowej HDAC do Rpd3 lub Hda1, dla HDAC11 podano identyczność/podobieństwo sekwencji do Hda1, a w nawiasach do Rpd3. HDAC posiadają konserwatywną domenę deacetylazy (DAC) z C- i N-końcowym ogonem przedstawionym jako czarne linie. Pokazano sygnały lokalizacji jądrowej, domeny wiążące czynnik wzmacniający miocyty-2 (MEF2-) oraz motywy wiążące 14-3-3 z miejscami fosforylacji seryny. Liczba reszt aminokwasowych najdłuższej izoformy każdego HDAC jest pokazana po prawej stronie, a miejsce chromosomalne każdego HDAC jest podane w nawiasach. H. sapiens: Homo sapiens; S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae; SE14: powtórzenia tetradecapeptydowe zawierające Ser-Glu; ZnF: domena palca cynkowego wiążąca się z ubikwityną. Adapted from .

2. Inhibitory deacetylazy histonowej

Several different structural groups of compounds are known to possess HDAC inhibition activity. Najszerzej badanym inhibitorem HDAC jest prototypowy kwas hydroksamowy, trichostatyna A . Trichostatyna A jest silnym antybiotykiem przeciwgrzybiczym, który został wyizolowany z metabolitu Streptomyces hygroscopicus. Jest to silny inhibitor HDAC o szerokim spektrum działania, a badania bezkomórkowe wskazują na stosunkowo wysokie powinowactwo do wszystkich enzymów klasy I, II i IV. Innym przykładem hydroksamu jest klinicznie dostępny kwas hydroksamowy suberojanilidu (SAHA, Vorinostat, Zolinza). Podobnie jak trichostatyna A, SAHA jest silnym inhibitorem HDAC o szerokim spektrum działania. Ze względu na silne działanie przeciwnowotworowe i korzystne okno terapeutyczne, SAHA został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia zaawansowanego skórnego chłoniaka T-komórkowego (CTCL) w 2006 roku. Inne kwasy hydroksamowe będące obecnie w fazie badań klinicznych to belinostat (PXD101), panobinostat (LBH589) i givinostat (ITF-2357). Ta klasa związków posiada aktywność hamowania HDAC w zakresie od nanomolarów do niskich mikromoli .

Cykliczne peptydy, które obejmują trapoxin i depsipeptyd są również silnymi inhibitorami HDAC. Depsipeptyd (Romidepsin, Istodax) został również zatwierdzony przez FDA do leczenia CTCL w 2009 roku. Podobnie benzamidy, do których należą entinostat (MS-275, SNDX 275) i MGCD0103 są silnymi inhibitorami HDAC o aktywności w zakresie niskich mikromoli. Najmniej silną klasą inhibitorów HDAC są kwasy alifatyczne, które posiadają aktywność w zakresie milimolarnym. Do tej grupy należy kwas walproinowy, związek, który jest szeroko stosowany w klinice jako lek przeciwpadaczkowy. Inny przykład kwasu alifatycznego, maślan sodu, wykorzystaliśmy do podkreślenia przeciwnowotworowego działania inhibitorów deacetylazy histonowej (rysunek 2).

W skrócie, inhibitory HDAC powodują akumulację hiperacetylowanych histonów i wykazano, że zmieniają ekspresję około 2-20% genów w złośliwych liniach komórkowych . Ogólnie, wykazano, że inhibitory HDAC zmniejszają proliferację komórkową, indukują śmierć komórek, apoptozę i różnicowanie, powodują zatrzymanie cyklu komórkowego (G1 przy niższych stężeniach i zarówno G1 jak i G2/M przy stosunkowo wysokich stężeniach) oraz zmniejszają migrację, inwazję i angiogenezę w złośliwych i przekształconych liniach komórkowych. Efekty działania inhibitorów HDAC są znacznie mniej wyraźne, co najmniej 10-krotnie, w komórkach prawidłowych, co stanowi podstawę ich przydatności klinicznej w chorobach nowotworowych. Aby potencjalnie poprawić indeks terapeutyczny inhibitorów HDAC w terapii nowotworów, zaproponowano związki klasowo-selektywne lub specyficzne dla danej izoformy. W tym kontekście przykładami są specyficzne dla danej izoformy tubacyna i PC-34051, które selektywnie hamują odpowiednio HDAC6 i HDA8. Oba związki wykazują ostatnio działanie przeciwnowotworowe. Kwestia selektywności pozostaje jednak kontrowersyjna, a argumenty sugerują, że plejotropowe działanie inhibitorów HDAC o szerokim spektrum działania, które są ogólnie dobrze tolerowane, może być korzystne w terapii nowotworów, biorąc pod uwagę heterogeniczność i zdolność adaptacji komórek złośliwych. Jednak ogólnie przyjmuje się, że związki selektywne będą najprawdopodobniej bardziej korzystne w nieonkologicznych zastosowaniach inhibitorów HDAC, które potencjalnie obejmują leczenie przerostu serca, astmy i różnych zaburzeń neurodegeneracyjnych

3. Terapie kombinatoryczne z inhibitorami deacetylazy histonowej

Pomimo, że posiadają one samoistne działanie przeciwnowotworowe, powszechnie przyjmuje się, że inhibitory HDAC będą najbardziej skuteczne, gdy będą stosowane w połączeniu z innymi metodami leczenia nowotworów. Istnieje wiele kombinacji, które są obecnie poddawane ocenie przedklinicznej i klinicznej. Należą do nich kombinacje z inhibitorami metylotransferaz, takimi jak azacytydyna, cytostatyki działające na receptory, takie jak kwas retinowy i fototerapia. Aby podkreślić zalety i potencjalne złożoności, skupimy się tutaj na połączeniach inhibitorów HDAC z konwencjonalnymi chemioterapeutykami antracyklinowymi i radioterapią (Rycina 3).

(a)

(b)

(a)
(b)

Antracykliny, określane przez daunomycynę i jej strukturalny analog doksorubicyny, są środkami chemioterapeutycznymi pierwszego rzutu w leczeniu nowotworów o historii klinicznej obejmującej ponad 50 lat. Są one dobrze znanymi interkalatorami DNA i inhibitorami enzymu topoizomerazy II. Mechanizm działania antracyklin polega na hamowaniu syntezy RNA, wytwarzaniu reaktywnych form tlenu i akumulacji zmian w DNA, w tym szczególnie śmiertelnych, podwójnych pęknięć nici DNA. W wielu badaniach wykazano, że inhibitory HDAC mogą potęgować cytotoksyczne działanie antracyklin. Na przykład, wykazano, że trichostatyna A zwiększa indukowaną doksorubicyną apoptozę i śmierć komórek w ludzkich komórkach erytroleukemicznych K562, raku anaplastycznym tarczycy i komórkach gruczolakoraka pęcherzykowego A549. Podobnie wykazano, że SAHA i kwas walproinowy zwiększają wrażliwość komórek nowotworowych na działanie doksorubicyny. Inhibitory HDAC indukują hiperacetylację histonów, powodując bardziej otwartą konformację chromatyny sprzyjającą transkrypcji, zjawisko to zostało zweryfikowane przez testy trawienia MNase. Ponadto wykazano, że inhibitory HDAC zwiększają liczbę miejsc wiążących, a także powinowactwo tych miejsc do antracyklin w acetylowanej chromatynie. Dlatego można spekulować, że inhibitory HDAC mogą zwiększać indukowaną antracyklinami śmierć komórek, przynajmniej częściowo, poprzez zmianę architektury chromatyny. Jednak zmiany w ekspresji genów i zmiany funkcji substratów niehistonowych są również związane z inhibitorem HDAC, co podkreślono w badaniach z inhibitorami selektywnymi pod względem izoform .

Dodatkowy i / lub synergistyczny efekt cytotoksyczny stanowi podstawę badań klinicznych z zastosowaniem kombinacji inhibitorów deacetylazy histonowej i antracyklin w różnych nowotworach złośliwych . Zidentyfikowano jednak potencjalne powikłania. Na przykład wykazano, że depsipeptyd powoduje wzrost ekspresji genu MDR1 w komórkach białaczkowych, co prowadzi do oporności na doksorubicynę. Ekspresja pompy P-glikoproteinowej, kodowanej przez MDR1, jest dobrze znana jako czynnik powodujący oporność wielolekową, główny problem kliniczny w onkologii, a możliwość odwrócenia represji genu MDR1 w komórkach złośliwych przez różne inhibitory HDAC została wskazana w dalszych badaniach. Z kolei inne, bardziej aktualne badania wskazują, że inhibitory HDAC mogą hamować ekspresję transporterów ABC, podkreślając, że kwestia ta wymaga dalszego wyjaśnienia .

Innym potencjalnym powikłaniem stosowania inhibitorów HDAC jest toksyczność sercowa. Badania wykazały, że inhibitory HDAC o szerokim spektrum działania mogą posiadać aktywność kardiotoksyczną per se. Dalsze badania wykazały, że wstępne traktowanie inhibitorami HDAC potęguje uszkadzające DNA i cytotoksyczne działanie doksorubicyny w systemach hodowli komórkowej. Wiadomo, że ograniczającym dawkę efektem ubocznym antracyklin jest nieodwracalna toksyczność sercowa spowodowana wytwarzaniem reaktywnych form tlenu, w tym szkodliwych rodników hydroksylowych i nadtlenku wodoru. Kardiomiocyty są szczególnie podatne, ponieważ mają stosunkowo niski poziom anionu ponadtlenkowego i enzymów detoksykujących nadtlenek wodoru w porównaniu z innymi typami komórek. Badania z wykorzystaniem odpowiedzi hipertroficznej i indukcji przerwania podwójnej nici DNA jako punktów końcowych wykazały, że inhibitory HDAC o szerokim spektrum działania, trichostatyna A, kwas walproinowy i maślan sodu, zwiększają działanie doksorubicyny. Podobnie, badania in vivo podkreślają kontrowersje dotyczące biologii inhibitorów HDAC w sercu. Na przykład, ostatnie odkrycia pokazują, że trichostatyna A i kwas walproinowy chronią przed przerostem serca wywołanym obciążeniem i agonistą in vivo. Jednak kontrastujące wyniki wskazują, że trichostatyna A pogarsza dysfunkcję prawej komory wywołaną przez opasanie tętnicy płucnej u szczurów. Biorąc pod uwagę te potencjalne komplikacje, kombinatoryczne działanie bardziej selektywnych lub izoformowospecyficznych inhibitorów HDAC z konwencjonalnymi lekami może zapewnić przewagę terapeutyczną. W tym kontekście, ostatnie badania wykazały, że związek selektywny dla HDAC6, tubacyna, potęguje działanie doksorubicyny i etopozydu w przekształconych liniach komórkowych. Przewiduje się dalsze oceny w tym kierunku.

4. Połączenie inhibitorów deacetylazy histonowej z radioterapią

Wczesne badania wykazały, że krótkołańcuchowy kwas tłuszczowy, maślan sodu, potęguje działanie cytotoksyczne promieniowania jonizującego na komórki raka okrężnicy i jamy nosowo-gardłowej. Chociaż do opisania tego efektu użyto nietypowego mechanizmu, dalsze badania wykazały, że prototypowy inhibitor HDAC, trichostatyna A, również zwiększa radiosensybilność komórek nowotworowych. Dalsze badania potwierdziły te odkrycia, wskazując, że praktycznie wszystkie inhibitory HDAC o szerokim spektrum działania, w tym trichostatyna A, SAHA, depsipeptyd, maślan sodu, fenylomaślan, tributyryna i kwas walproinowy, potęgują indukowaną promieniowaniem śmierć komórek w komórkach złośliwych. Przy stosunkowo wysokich stężeniach inhibitora HDAC zaobserwowano współczynniki modyfikacji dawki (stosunek dawek promieniowania w komórkach poddanych i nie poddanych działaniu inhibitora HDAC, które dają ten sam poziom przeżycia) o wartości ~2. Spekuluje się, że przy tych wyższych stężeniach, zatrzymanie cyklu komórkowego (G1 i G2), zahamowanie syntezy DNA i indukcja apoptozy przez inhibitory HDAC odpowiada za efekt uwrażliwiający na promieniowanie. Przy stosunkowo niższych stężeniach inhibitorów HDAC również obserwuje się efekt uwrażliwiający na promieniowanie. Wiele badań wykazało związek pomiędzy inhibicją HDAC a białkami zaangażowanymi w kaskady sygnałowe w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Podsumowując, radioterapeutyczne działanie inhibitorów HDAC może wiązać się z następującymi mechanizmami. Po pierwsze, hiperacetylacja histonów zmienia architekturę chromatyny, w wyniku czego powstaje bardziej otwarte potwierdzenie chromatynowe, które może być bardziej podatne na początkowe uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem. Po drugie, inhibitory HDAC mogą wchodzić w interakcje z kluczowymi białkami transdukcji sygnału zaangażowanymi w szlaki odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Wreszcie, wykazano, że inhibitory HDAC regulują transkrypcję genów zaangażowanych w szlak naprawy uszkodzeń podwójnej nici DNA. Na przykład wykazano, że wstępne traktowanie SAHA osłabia indukowany promieniowaniem wzrost aktywności białek naprawy DNA Rad51 i DNA-PKcs . Podobnie wykazano, że maślan sodu zmniejsza ekspresję białek naprawy DNA Ku70, Ku86 i DNA-PKcs w liniach komórkowych czerniaka. Ponadto, stosując bleomycynę, doksorubicynę i etopozyd w celu wywołania przerwania podwójnej nici DNA, ocenianego na podstawie akumulacji ognisk γH2AX, wykazano, że inhibitory deacetylazy histonowej kierują acetylację Ku70, co prowadzi do uwrażliwienia.

W kontekście kombinacji z radioterapią ważny jest kwas walproinowy, który ma długą historię kliniczną w leczeniu padaczki. Badania przedkliniczne wykazały, że inhibitor HDAC uwrażliwia ludzkie linie komórkowe glejaka na działanie promieniowania jonizującego (promieniowanie rentgenowskie) zarówno in vitro, jak i in vivo. Jak ostatnio przeglądano, kwas walproinowy został połączony ze środkiem alkilującym temozolomidem i promieniowaniem w potencjalnym leczeniu glejaka wielopostaciowego. Strategia ta jest obecnie poddawana ocenie w badaniu klinicznym II fazy .

5. Radioprotective Effects of Histone Deacetylase Inhibitors

Paradoksalnie, pojawiające się dowody wskazują, że inhibitory HDAC posiadają aktywność radioprotekcyjną. Wczesne badania wskazały, że wstępne traktowanie fenylomaślanem oferuje skromny efekt promieniochronny w ludzkich normalnych i nowotworowych komórkach. Dalsze badania wykazały, że fenylomaślan chroni przed skórnym zespołem popromiennym in vivo. Uważa się, że właściwości radioprotekcyjne inhibitorów HDAC wiążą się z represją cytokin zapalnych (np. interleukiny (IL-) 1, IL-8, czynnika martwicy nowotworów (TNF-)α) i fibrogennych czynników wzrostu (np. transformującego czynnika wzrostu (TGF-)β). Wiadomo, że są one zaangażowane w odpowiedź zapalną na promieniowanie, a w szczególności przedłużone wydzielanie TNF-α i TGF-β z komórek nabłonka, śródbłonka i tkanki łącznej jest związane z zespołem popromiennym skóry. Oprócz fenylomaślanu, wykazano, że inhibitory HDAC o szerokim spektrum działania, trichostatyna A i kwas walproinowy, chronią przed uszkodzeniem skóry wywołanym promieniowaniem oraz przed śmiertelnością wywołaną promieniowaniem u myszy. Efekty te były również skorelowane z obniżoną ekspresją TNF-α, TGF-β1 i TGF-β2. Dalsze badania w tym kierunku z użyciem fenylomaślanu wykazały, że inhibitor HDAC może chronić myszy przed ostrą śmiertelnością wywołaną promieniowaniem γ. Efekty te były skorelowane z tłumieniem uszkodzeń DNA i apoptozy. Co ciekawe, podawanie fenylomaślanu zarówno profilaktycznie, jak i po napromieniowaniu zapewniało ochronę radiologiczną, co stanowi interesujący potencjał kliniczny. Profilaktyka byłaby właściwa w przypadku radioterapii przed narażeniem na napromieniowanie, a podawanie po napromieniowaniu byłoby właściwe w przypadkach nieumyślnego narażenia na promieniowanie.

6. Wnioski

InhibitoryHDAC pojawiły się jako ważna nowa klasa leków przeciwnowotworowych. Chociaż same posiadają silne działanie cytotoksyczne i apoptotyczne, przewiduje się, że będą one najbardziej użyteczne, gdy będą stosowane w połączeniu z innymi metodami leczenia nowotworów. Znajduje to odzwierciedlenie w większości prowadzonych obecnie badań klinicznych, w których inhibitory HDAC są łączone z konwencjonalnymi chemioterapeutykami i radioterapią. Ważnym pytaniem w tej dziedzinie pozostaje, czy związki klasycznie selektywne lub specyficzne dla danej izoformy będą miały większą skuteczność terapeutyczną niż klasyczne inhibitory HDAC o szerokim spektrum działania. Inhibitory HDAC o szerokim spektrum działania wykazują plejotropowe działanie przeciwnowotworowe, co może być korzystne ze względu na heterogenność i zdolności adaptacyjne komórek nowotworowych. Z drugiej strony, związki selektywne pod względem klas lub izoform mogą oferować większe okno terapeutyczne z mniejszym efektem off-target. Obecnie prowadzone są intensywne badania mające na celu dalsze zrozumienie funkcji enzymów HDAC, a dostępność bardziej specyficznych związków jest coraz większa. Dlatego też oczekuje się, że kwestia selektywności zostanie wyjaśniona, być może otwierając dalsze możliwości klinicznego zastosowania tej klasy związków.

Konflikt interesów

Zarówno K. Ververis, jak i T. C. Karagiannis deklarują, że nie mają bezpośredniej relacji finansowej z podmiotami komercyjnymi wymienionymi w tej pracy, która mogłaby prowadzić do konfliktu interesów.

Podziękowania

Przyznaje się wsparcie Australian Institute of Nuclear Science and Engineering. T. C. Karagiannis był laureatem nagród AINSE. Epigenomic Medicine Laboratory jest wspierane przez National Health and Medical Research Council of Australia. K. Ververis jest wspierany przez Baker IDI postgraduate scholarship. Niniejsza praca została częściowo wsparta przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii. Autorzy chcieliby podziękować za korzystanie z urządzeń dostarczonych przez Monash Micro Imaging w AMREP oraz, w szczególności, za fachową pomoc ze strony dr Stephena Cody’ego i Iśki Carmichael.