Identyfikacja i charakterystyka nowej neurotoksyny botulinowej

Przeszukiwanie genomowych baz danych ujawniło nowy gen BoNT

Próbując zbadać krajobraz ewolucyjny BoNT, przeprowadziliśmy iteracyjne przeszukiwanie sekwencyjnej bazy danych Uniprot za pomocą modelu Ukrytego Markowa. Nasze poszukiwania zidentyfikowały wszystkie znane podtypy BoNT i toksyny mozaikowe, jak również pokrewną neurotoksynę tężcową (Rys. 1a; Supplementary Fig. 1). Ku naszemu zaskoczeniu, wyszukiwanie ujawniło potencjalnie nową BoNT, wstępnie oznaczoną jako BoNT/X (ryc. 1a, nr GenBank: BAQ12790.1), pochodzącą z niedawno opisanej sekwencji genomowej szczepu 111 C. botulinum. BoNT/X wykazywał najmniejszą identyczność sekwencji białkowej z pozostałymi BoNT w porównaniach parami (Rys. 1b). Ponadto, niskie podobieństwo sekwencji jest równomiernie rozłożone wzdłuż całej sekwencji BoNT/X (Rys. 1c), co wskazuje, że nie jest to toksyna mozaikowa. Pomimo tej niskiej identyczności sekwencji, ogólny układ domen BoNT jest zachowany w BoNT/X (ryc. 1c), w tym zależny od cynku motyw proteazy HEXXH (reszty 227-231, HELVH) w LC (ref. 33) i motyw SXWY w HC (reszty 1,274-1,277, SAWY), który rozpoznaje lipidowy receptor gangliozydów34.

(a) Rozszczepiona sieć filogenetyczna obejmująca wszystkie serotypy, podtypy, toksyny mozaikowe i pokrewną neurotoksynę tężcową (TeNT) ilustruje ich potencjalne związki ewolucyjne, jak również konflikty wynikające np. z chimeryzmu, na podstawie sekwencji ich białek. BoNT/X jest zaznaczona na czerwono. Powiększona wersja tego panelu jest pokazana na Rys. 1, z zaznaczonym numerem dostępu do sekwencji dla każdego genu toksyny. (b) Drzewo filogenetyczne wyrównania sekwencji białek dla BoNT/A-G, TeNT i BoNT/X, analizowane metodą ClustalW. Odnotowano procent identyczności sekwencji między każdą toksyną a BoNT/X. (c) Górny panel: schematyczny rysunek trzech domen BoNT/X, z zaznaczonym konserwowanym motywem proteazy w LC i motywem wiązania gangliozydów w HC. Panel dolny: analiza z użyciem przesuwanego okna porównania sekwencji wykazała, że niskie podobieństwo między BoNT/X a innymi BoNT/TeNT jest równomiernie rozłożone wzdłuż całej sekwencji BoNT/X. Oś X przedstawia pozycję sekwencji zapytania w centrum 100-aminokwasowego przesuwnego okna porównania sekwencji. Oś Y pokazuje procent identyczności pomiędzy tym oknem sekwencji a każdą z wyrównanych sekwencji tła. Dwa słupki na górze wykresu ilustrują najlepiej dopasowaną sekwencję (dolny słupek) i czy najlepsze dopasowanie jest znacząco oddzielone od drugiego najlepszego dopasowania (górny słupek). (d) Schematyczny rysunek klastra genów orf, w którym znajduje się gen BoNT/X (górny panel), który ma dwie odrębne cechy w porównaniu z innymi znanymi klastrami orfX (środkowy i dolny panel): (1) istnieje dodatkowe białko orfX2 (oznaczone jako orfX2b) zlokalizowane obok genu BoNT/X; (2) ramka odczytu genów orfX ma ten sam kierunek co gen BoNT/X.

Podobnie jak w przypadku innych BoNT, gen BoNT/X znajduje się w klastrze genów23. Wszystkie siedem ustalonych BoNT jest współekspresjonowanych z innym białkiem o masie 150 kDa, znanym jako NTNHA (nietoksyczne białko niehemaglutyninowe), które tworzy z BoNT kompleks zależny od pH i chroni je przed proteazami w przewodzie pokarmowym35. Gen BoNT/X jest również poprzedzony potencjalnym genem NTNHA (ryc. 1d). Oprócz BoNT i NTNHA, typowy klaster genów BoNT zawiera geny kodujące jeden z dwóch typów białek akcesoryjnych: (1) klaster HA kodujący trzy konserwowane białka HA17, HA33 i HA70, które tworzą kompleks z BoNT/NTNHA i ułatwiają wchłanianie toksyn przez barierę nabłonka jelitowego36,37,38; lub (2) klaster OrfX kodujący konserwowane białka OrfX1, OrfX2, OrfX3 i P47 o nieznanej funkcji23. Gen BoNT/X jest zlokalizowany w klastrze genów OrfX, podobnie jak BoNT/E, F i członkowie BoNT/A. Co ciekawe, klaster BoNT/X ma dwie unikalne cechy (Ryc. 1d): (1) istnieje dodatkowy gen OrfX2, który nie występuje w żadnych innych klastrach BoNT (oznaczyliśmy go jako OrfX2b); (2) ramka odczytu genów OrfX jest zwykle przeciwna do genów BoNT/NTNHA, ale ma ten sam kierunek co gen BoNT/X w klastrze BoNT/X (Ryc. 1d). Odkrycia te sugerują, że BoNT/X jest unikalną gałęzią rodziny BoNT.

LC BoNT/X rozszczepia VAMP2 w nowym miejscu

Aby scharakteryzować BoNT/X, najpierw skupiliśmy się na jego LC (X-LC, reszty 1-439) i wyprodukowaliśmy go jako białko znakowane His6 w Escherichia coli. LC BoNT/A (A-LC) i BoNT/B (B-LC) były produkowane i badane równolegle jako kontrole. Inkubacja X-LC z detergentowymi ekstraktami mózgu szczura (BDE) nie wpłynęła na syntaksynę 1 lub SNAP-25, ale zniosła sygnały immunoblotu VAMP2 (ryc. 2a). LC BoNTs są proteazami zależnymi od cynku33. Zgodnie z oczekiwaniami, EDTA zapobiegał rozszczepianiu białek SNARE przez X-, A- i B-LC (ryc. 2a). Ponadto, inkubacja X-LC z oczyszczoną rekombinowaną cytozolową domeną VAMP2 (reszty 1-93) przekształciła VAMP2 w dwa pasma o mniejszej masie cząsteczkowej (Rys. 2b), potwierdzając, że X-LC rozszczepia VAMP2.

(a) X-LC inkubowano z BDE. Przeprowadzono analizę immunoblot w celu wykrycia syntaksyny 1, SNAP-25 i VAMP2. Synaptofizyna (Syp) służyła jako kontrola obciążenia. A-LC i B-LC były analizowane równolegle. Rozszczepienie VAMP2 przez B-LC powoduje utratę sygnału immunoblotu, natomiast rozszczepienie SNAP-25 przez A-LC generuje mniejszy fragment (oznaczony gwiazdką). EDTA blokował aktywność X-, A- i B-LC. (b) VAMP2 (1-93) inkubowano z X-LC. Próbki analizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie. X-LC przekształciła VAMP2 (1-93) w dwa mniejsze fragmenty. (c-e) VAMP2 (1-93) inkubowano z X-LC. Próbki analizowano metodą spektrometrii mas (LC-MS/MS) w celu określenia masy cząsteczkowej rozszczepionych fragmentów. Wydzielone piki peptydowe z kolumny HPLC są wykreślone w zależności od czasu trwania reakcji (RT, oś X). Dane spektrometrii masowej dla dwóch produktów rozszczepienia są oznaczone kolorami, z odnotowanym stosunkiem masy do ładunku (m/z). Masa cząsteczkowa jest obliczana przez pomnożenie m przez z, a następnie odjęcie z. Sekwencje białek dla dwóch produktów rozszczepienia są oznaczone kolorami i wymienione w c. (f) Wyrównanie sekwencji pomiędzy członkami rodziny VAMP, z miejscami rozszczepienia dla BoNT/B, D, F, G i X zaznaczonymi na czerwono oraz dwoma motywami SNARE w niebieskim odcieniu. (g) VAMP1, 3, 7 i 8 znakowane HA oraz Sec22b i Ykt6 znakowane Myc uległy ekspresji w komórkach 293T poprzez transfekcję przejściową. Lizaty komórkowe inkubowano z X-LC i poddawano analizie immunoblot. Aktyna stanowi kontrolę obciążenia. (h) Ykt6 znakowany GST był inkubowany z X-LC (100 nM). Próbki analizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie. (i) VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) i VAMP5 (1-70) znakowane GST inkubowano z X-LC (100 nM). Próbki analizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie. X-LC rozszczepiał zarówno VAMP4 jak i VAMP5. Zwracamy uwagę, że białko VAMP5 zawiera pasmo zanieczyszczeń, które przebiega w pobliżu produktu rozszczepienia. (j) Eksperymenty przeprowadzono w sposób opisany w punkcie a, z wyjątkiem wykrywania VAMP4 i Sec22b. Synaptotagmina I (Syt I) stanowi kontrolę obciążenia. X-LC rozszczepia natywny VAMP4 w BDE. Pokazano jeden z dwóch (b,g,j) lub trzech (a,h,i) niezależnych eksperymentów.

Aby zidentyfikować miejsce rozszczepienia, przeanalizowaliśmy białko VAMP2 (1-93), z lub bez preinkubacji z X-LC, za pomocą chromatografii cieczowej-tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS, ryc. 2c-e). Po inkubacji z X-LC pojawił się pojedynczy dominujący pik peptydowy (Rys. 2c,e; Supplementary Fig. 2). Jego masa cząsteczkowa wynosi 3,081.7, co pasuje jedynie do sekwencji peptydowej A67-L93 VAMP2 (Rys. 2c,e). Konsekwentnie, inny fragment od początku His6-tagu do reszty R66 VAMP2 został również wykryty (Rys. 2d). Aby jeszcze bardziej potwierdzić to odkrycie, powtórzyliśmy badanie z innym fragmentem VAMP2: VAMP2 znakowanym S-transferazą glutationową (GST) (33-86) (Rys. 3). Inkubacja z X-LC wygenerowała pojedynczy dominujący pik peptydowy o masie cząsteczkowej 2,063.1, który pasuje tylko do A67-R86 VAMP2 (Supplementary Fig. 3). Łącznie te wyniki pokazują, że X-LC ma pojedyncze miejsce rozszczepienia na VAMP2 między R66 i A67.

R66-A67 jest nowym miejscem rozszczepienia na VAMP2, różnym od wszystkich ustalonych miejsc docelowych BoNTs (ryc. 2f). Jest to również jedyne miejsce rozszczepienia BoNT zlokalizowane w regionie znanym wcześniej jako motyw SNARE (ryc. 2f, zacienione regiony)39. Do rodziny białek VAMP należą VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 i 8, a także pokrewne Sec22b i Ykt6. R66-A67 jest konserwowane w VAMP1 i 3, które są wysoce homologiczne do VAMP2. Aby potwierdzić specyficzność X-LC, dokonaliśmy ekspresji znakowanych HA VAMP1, 3, 7, 8 oraz znakowanych Myc Sec22b i Ykt6 w komórkach HEK293 poprzez transfekcję przejściową. Lizaty komórkowe były inkubowane z X-LC. Zarówno VAMP1 i 3 były rozszczepiane przez X-LC, podczas gdy VAMP7, VAMP8 i Sec22b były oporne na X-LC (ryc. 2g).

BoNT/X rozszczepia VAMP4, VAMP5 i Ykt6

Niespodziewanie Ykt6 był również rozszczepiany przez X-LC (ryc. 2g). Wynik ten został potwierdzony przy użyciu oczyszczonego fragmentu Ykt6 znakowanego GST, który po inkubacji z X-LC przesunął się do pasma o mniejszej masie cząsteczkowej (Rys. 2h). Miejsce rozszczepienia zostało określone jako K173-S174 na podstawie analizy spektrometrii masowej nienaruszonego Ykt6 i Ykt6 rozszczepionego przez X-LC (Supplementary Fig. 4). Miejsce to jest homologiczne do miejsca rozszczepienia BoNT/X na VAMP2 (ryc. 2f). Spośród białek rodziny VAMP, VAMP4 zawiera w tym miejscu taką samą parę reszt (K87-S88) jak Ykt6. Stwierdziliśmy, że X-LC rozszczepia zarówno oczyszczoną, znakowaną GST cytoplazmatyczną domenę VAMP4 (Rys. 2i), jak i natywną VAMP4 w BDE (Rys. 2j). Jako kontrola, Sec22b nie był rozszczepiany przez X-LC w BDE. Ponadto, znakowana GST cytoplazmatyczna domena VAMP5 również ulegała rozszczepieniu (Rys. 2i). Miejsca rozszczepienia zostały określone na podstawie analizy spektrometrii mas jako K87-S88 w VAMP4 i R40-S41 w VAMP5 (Rys. 5). Oba miejsca są homologiczne do miejsca rozszczepienia BoNT/X na VAMP2 (ryc. 2f), co dowodzi, że lokalizacja miejsca rozszczepienia jest konserwowana przez różne VAMP. Zdolność X-LC do rozszczepiania VAMP4, VAMP5 i Ykt6 jest wysoce niezwykła, ponieważ ich sekwencje różnią się zasadniczo od sekwencji VAMP1/2/3. BoNT/X jest pierwszym i jedynym znanym BoNT, który może rozszczepiać VAMP poza kanonicznymi celami VAMP1, 2 i 3 (ref. 40).

Proteolityczna aktywacja BoNT/X

Następnie zbadaliśmy region łącznika pomiędzy LC i HC, który musi być rozszczepiony przez proteazy bakteryjne lub gospodarza, aby przekształcić toksynę w „aktywną” formę dwułańcuchową. Wyprodukowaliśmy rekombinowany fragment X-LC-HN (reszty 1-891) w E. coli i poddaliśmy go ograniczonej proteolizie przez endoproteinazę Lys-C. Próbki analizowano za pomocą tandemowej analizy tandemowej. Próbki analizowano przy użyciu znakowania Tandem Mass Tag (TMT) i tandemowej spektrometrii mas. TMT znakuje wolne N-końce (i lizyny). Ograniczona proteoliza przez Lys-C wytworzyła jeden nowy wolny N-terminus zmapowany do reszty N439 w regionie linkera (Fig. 3a; Dane uzupełniające 1), potwierdzając, że region linkera jest podatny na działanie proteaz.

(a) Wyrównanie sekwencji linkera między LC i HC siedmiu ustalonych BoNT i BoNT/X. Miejsce cięcia Lys-C zidentyfikowano na podstawie analizy spektrometrii mas (patrz Metoda i Dane Uzupełniające 1). (b) Hodowlane neurony korowe szczura poddano działaniu X-LC-HN przez 12 h. Zebrano lizaty komórkowe i przeprowadzono analizę immunoblot w celu zbadania syntaksyny 1, SNAP-25 i VAMP2. Aktyna jest kontrolą obciążenia. Aktywowane trypsyną A-LC-HN i B-LC-HN były analizowane równolegle. X-LC-HN wnikała do neuronów i rozszczepiała VAMP2. X-LC-HN aktywowany przez Lys-C wykazywał większą siłę działania niż nieaktywowany X-LC-HN. X-LC-HN była silniejsza niż B-LC-HN i A-LC-HN, z których żadna nie rozszczepiała swoich substratów. (c) WT i zmutowane X-LC-HN były aktywowane przez Lys-C i analizowane przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie, z lub bez DTT. Mutanty C461S i C467S pokazywały się jako pojedyncze pasmo przy ∼ 100 kDa bez DTT i rozdzielały się na dwa pasma przy ∼ 50 kDa z DTT. Część WT X-LC-HN tworzyła agregaty, oznaczone gwiazdką, które znikały po podaniu DTT. Większość aktywowanego WT X-LC-HN rozdzieliła się na dwa pasma ∼50 kDa bez DTT. Wynika to z przemieszania wiązań disiarczkowych, jak opisano w następnym panelu. (d) Aktywowany Lys-C WT X-LC-HN był inkubowany z NEM w celu zablokowania tasowania wiązań disiarczkowych. Próbki były następnie analizowane przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie. Większość WT X-LC-HN występuje jako pojedyncze pasmo przy ∼100 kDa bez DTT po traktowaniu NEM, co wskazuje, że natywny WT X-LC-HN zawiera międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe. (e) Schematyczne rysunki wiązania disiarczkowego w WT i trzech mutantach cysteinowych BoNT/X. (f) Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z opisem w b, z tym że neurony eksponowano na WT lub mutanty X-LC-HN. Mutacja C423S znosiła aktywność X-LC-HN, podczas gdy mutacja C461 lub C467 nie wpływała na aktywność X-LC-HN. Wyniki te potwierdziły, że międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe jest niezbędne do aktywności X-LC-HN, a to międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe może być tworzone przez C423-C461 lub C423-C467. Pokazano jeden z dwóch (b) lub trzech (b,c,f) niezależnych eksperymentów.

Następnie zbadaliśmy, czy aktywacja proteolityczna zwiększa siłę działania BoNT/X. Wykazano, że inkubacja wysokich stężeń LC-HN BoNTs z hodowanymi neuronami powoduje wnikanie LC-HN, prawdopodobnie poprzez niespecyficzny wychwyt do neuronów41. Podobnie, X-LC-HN wnikał do hodowanych neuronów korowych szczura i rozszczepiał VAMP2 w sposób zależny od stężenia (ryc. 3b). Aktywacja przez Lys-C zwiększyła siłę działania X-LC-HN: 10 nM aktywowanego X-LC-HN rozszczepiło podobny poziom VAMP2 jak 150 nM nienaruszonego X-LC-HN (ryc. 3b). Aktywowany X-LC-HN wydaje się być silniejszy niż aktywowany LC-HN BoNT/A (A-LC-HN) i BoNT/B (B-LC-HN), które nie wykazywały wykrywalnego rozszczepienia swoich substratów w tych samych warunkach badania (Rys. 3b).

Międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe w BoNT/X

Podobnie jak inne BoNT, region linkera BoNT/X zawiera dwie konserwowane cysteiny, ale istnieje również dodatkowa cysteina (C461) unikalna dla BoNT/X (Fig. 3a). Aby określić reszty cysteinowe, które tworzą niezbędne międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe, wygenerowaliśmy trzy mutanty X-LC-HN, każdy z mutacją jednej z trzech reszt cysteinowych (C423S, C461S i C467S). Mutanty te, jak również X-LC-HN typu dzikiego (WT), poddano ograniczonej proteolizie przy użyciu Lys-C, a następnie analizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie, z lub bez czynnika redukującego – ditiothreitolu (DTT; Rys. 3c). Oczekuje się, że mutacja jedynej cysteiny na LC (C423S) zlikwiduje międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe. Konsekwentnie, mutant C423S rozdzielał się na dwa pasma ∼50 kDa bez DTT. Z kolei mutanty C461S i C467S wykazywały pojedyncze pasmo przy 100 kDa przy braku DTT i rozdzielały się na dwa pasma ∼50 kDa w obecności DTT. Wyniki te sugerowały, że C423 na LC może tworzyć międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe z C461 lub C467 na HC. Stwierdziliśmy również, że traktowanie Lys-C degradowało znaczną część mutanta C423S w porównaniu z mutantami C461S lub C467S (Rys. 3c, +DTT), sugerując, że utrata międzyłańcuchowego wiązania disiarczkowego czyni cząsteczkę bardziej podatną na działanie proteaz. Zauważyliśmy, że część WT X-LC-HN tworzyła agregaty w górnej części żelu SDS-PAGE (Rys. 3c, oznaczone gwiazdką). Agregaty te znikały w obecności DTT. C423/C461/C467 to jedyne trzy cysteiny w X-LC-HN; mutacja którejkolwiek z nich znosi tworzenie agregatów (Rys. 3c, -DTT), co sugeruje, że agregaty te są tworzone przez międzycząsteczkowe wiązania disiarczkowe z powodu istnienia dodatkowej cysteiny w regionie łącznika.

Co ciekawe, większość aktywowanego WT X-LC-HN rozdzieliła się na dwa pasma ∼50 kDa bez DTT (ryc. 3c), co jest podobne do mutanta C423S. Z drugiej strony, WT X-LC-HN nie wykazywał zwiększonej degradacji przez Lys-C w porównaniu z mutantem C423S (Rys. 3c, +DTT). Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że WT X-LC-HN zawiera międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe w warunkach natywnych, ale wiązanie to może ulec rearanżacji do wewnątrzłańcuchowej pary C461-C467 w warunkach denaturujących w buforze SDS. Zjawisko to znane jest jako przemieszanie wiązania disulfidowego, które często występuje pomiędzy sąsiadującymi cysteinami. Aby sprawdzić tę hipotezę, zastosowaliśmy odczynnik alkilujący, N-etylomaleimid (NEM), który trwale blokuje wolne cysteiny i zapobiega przemieszaniu wiązań disulfidowych. Jak pokazano na Rys. 3d, WT X-LC-HN poddany działaniu NEM pokazał się jako pojedyncze pasmo przy 100 kDa w nieobecności DTT i rozdzielił się na dwa pasma ∼50 kDa w obecności DTT. Wyniki te potwierdzają, że WT X-LC-HN zawiera głównie międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe, ale jest podatny na tasowanie wiązań disiarczkowych z powodu dodatkowej cysteiny w regionie linkera (ryc. 3e).

Badaliśmy dalej aktywność trzech mutantów cysteinowych X-LC-HN na hodowanych neuronach. Zgodnie z oczekiwaniami, mutant C423S był nieaktywny, podczas gdy mutanty C461S i C467S wykazywały podobne poziomy aktywności jak WT X-LC-HN (ryc. 3f). Wyniki te potwierdzają, że międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe jest krytyczne dla aktywności BoNT/X.

Generowanie pełnej długości BoNT/X przez sortase-mediated ligation

Później staraliśmy się ustalić, czy pełna długość BoNT/X jest funkcjonalną toksyną. Ponieważ nie są dostępne antysurowice przeciwko BoNT/X, zdecydowaliśmy się uniknąć generowania aktywnego genu toksyny o pełnej długości. Zamiast tego, opracowaliśmy metodę generowania ograniczonej ilości pełnowartościowych BoNT w probówkach poprzez enzymatyczną ligację dwóch nietoksycznych fragmentów BoNT. Metoda ta wykorzystuje transpeptydazę znaną jako sortaza42,43, która rozpoznaje motyw peptydowy LPXTG, rozszczepia pomiędzy T-G i jednocześnie tworzy nowe wiązanie peptydowe z innymi białkami/peptydami zawierającymi N-końcową glicynę (Rys. 4a). Wyprodukowaliśmy dwa nietoksyczne fragmenty BoNT/X: (1) LC-HN z motywem LPETGG i znacznikiem His6 przyłączonym do C-końca; oraz (2) HC BoNT/X (X-HC) ze znacznikiem GST, miejscem cięcia trombiną i dodatkową resztą glicynową na N-końcu. Cięcie przez trombinę uwalnia X-HC z wolną glicyną na jego N-końcu. Inkubacja tych dwóch fragmentów z sortazą wytworzyła niewielką ilość ∼150 kD pełnowartościowego BoNT/X (X-FL, ryc. 4a,b). Zwracamy uwagę, że X-HC wykazywał słabą rozpuszczalność i silną tendencję do agregacji, co może być przyczyną niskiej wydajności ligacji (Rys. 4b). W przeciwieństwie do tego, ligacja X-LC-HN z HC BoNT/A (A-HC) osiągnęła lepszą wydajność, przy czym większość X-LC-HN została ligowana do toksyny chimerycznej XA (Supplementary Fig. 6a). Aby zapewnić biobezpieczeństwo, ilość fragmentów prekursorowych w reakcji jest ściśle ograniczona w celu wygenerowania minimalnej ilości zdigitalizowanej toksyny niezbędnej do badań funkcjonalnych.

(a) Schematyczny rysunek metody ligacji sortazowej. (b) Mieszaniny po reakcji ligacji sortazowej analizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie Blue. Gwiazdką zaznaczono agregaty białek spowodowane międzycząsteczkowymi wiązaniami disulfidowymi. Pełnowymiarowy BoNT/X (X-FL) pojawił się tylko w mieszaninie ligacyjnej sortaz. (c) Neurony poddane działaniu mieszaniny ligacyjnej sortaz (15 μl) lub mieszaniny kontrolnej przez 12 h w podłożu hodowlanym. Lizaty komórkowe analizowano metodą immunoblot. Mieszanina zawierająca zarówno X-LC-HN jak i X-HC (ale nie sortazę) rozszczepiała nieco więcej VAMP2 niż sama X-LC-HN. Ligacja X-LC-HN i X-HC przez sortazę jeszcze bardziej zwiększyła rozszczepienie VAMP2, wykazując, że ligowany X-FL jest funkcjonalny w neuronach. (d) BoNT/A-G, BoNT/DC i BoNT/X poddano testowi dot blot, używając czterech antysurowic końskich (trójwartościowa anty-BoNT/A, B i E, anty-BoNT/C, anty-BoNT/DC i anty-BoNT/F), jak również dwóch antysurowic kozich (anty-BoNT/G i anty-BoNT/D). BoNT/X składa się z X-LC-HN i X-HC w stosunku molowym 1:1. Antysurowice te rozpoznały odpowiadające im toksyny docelowe, ale żadna nie rozpoznała BoNT/X. Antysurowice przeciwko BoNT/DC i BoNT/C reagują krzyżowo, ponieważ te dwie toksyny mają wysoki stopień podobieństwa w swoich domenach HC. (e) Hodowlane neurony korowe szczura były eksponowane na podwiązany X-FL w medium hodowlanym przez 12 h, z lub bez dwóch kombinacji antysurowic. Ab1: trójwartościowe anty-BoNT/A/B/E, anty-BoNT/C i anty-BoNT/F. Ab2: anty-BoNT/G i anty-BoNT/D. Trójwartościowe anty-BoNT/A/B/E stosowano w rozcieńczeniu 1:50. Wszystkie pozostałe antysurowice stosowano w rozcieńczeniu 1:100. Żadna z tych surowic nie wpływała na rozszczepienie VAMP2 i VAMP4 przez X-FL. Swoistość i siłę działania tych surowic potwierdzono pod kątem ich zdolności do neutralizacji docelowych serotypów w tym samym teście, jak opisano na dodatkowym ryc. 7. (f) X-FL połączony przez reakcję sortazową (0,5 μg) wstrzykiwano do mięśni brzuchatych prawej tylnej kończyny myszy (n=4). Na wstrzykniętej kończynie wystąpił typowy paraliż wiotki, a palce nie rozłożyły się w ciągu 12 h. Lewej kończyny nie wstrzykiwano toksyn, służąc jako kontrola. (g) Nieaktywna forma BoNT/X (BoNT/XRY) o pełnej długości została oczyszczona w E. coli jako rekombinowane białko znakowane His6. Dalsze oczyszczone BoNT/XRY pokazano na Suplementarnym Rys. 8b. Pokazano jeden z dwóch (e) lub trzech (c,d) niezależnych eksperymentów.

Początkowo analizowaliśmy aktywność podwiązanego BoNT/X przy użyciu hodowanych szczurzych neuronów korowych. Neurony wystawiono na działanie mieszaniny ligacyjnej sortaz i mieszanin kontrolnych w medium hodowlanym. Jak pokazano na Rys. 4c, sam X-LC-HN rozszczepił część VAMP2 ze względu na jego wysokie stężenie w mieszaninie reakcyjnej. Mieszanie X-HC z X-LC-HN bez sortazy nieznacznie zwiększyło rozszczepienie VAMP2 w porównaniu z samym X-LC-HN, co sugeruje, że X-HC może być związany z X-LC-HN poprzez niekowalencyjne interakcje. Ta interakcja wydaje się być specyficzna, ponieważ mieszanie A-HC z X-LC-HN nie zwiększało rozszczepienia VAMP2 w neuronach (Supplementary Fig. 6b). Ligacja X-LC-HN z X-HC przez sortazę wyraźnie zwiększyła rozszczepienie VAMP2 w porównaniu z mieszaniną X-LC-HN i X-HC bez sortazy (Fig. 4c). Wyniki te wykazały, że X-HC jest funkcjonalny w kierowaniu komórek i że podwiązany pełnometrażowy BoNT/X wnika do neuronów i rozszczepia VAMP2. Podobnie, podwiązany XA również wnikał do neuronów i rozszczepiał VAMP2 (Supplementary Fig. 6b).

BoNT/X nie był rozpoznawany przez antysurowice przeciwko znanym BoNTs

Następnie przeprowadziliśmy testy dot blot z użyciem antysurowic podniesionych przeciwko znanym BoNTs, w tym wszystkim siedmiu serotypom, jak również jednej toksynie mozaikowej (BoNT/DC), aby potwierdzić, że BoNT/X jest serologicznie unikalny. Wykorzystano cztery antysurowice końskie (trójwartościowa anty-BoNT/A, B i E, anty-BoNT/C, anty-BoNT/DC i anty-BoNT/F) oraz dwie antysurowice kozie (anty-BoNT/G i anty-BoNT/D). Specyficzność i siłę działania tych surowic zwalidowano najpierw analizując ich zdolność do neutralizacji BoNT na hodowanych neuronach. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie antysurowice neutralizowały docelowe BoNTs, bez wpływu na aktywność innego serotypu (Supplementary Fig. 7). Stwierdziliśmy, że te antysurowice rozpoznały odpowiadające im BoNTs w teście dot blot, ale żadna nie rozpoznała BoNT/X (ryc. 4d).

Dalej analizowaliśmy, czy toksyczność BoNT/X na neuronach może być neutralizowana przez te antysurowice. X-FL generowane przez sortase-mediated ligation było najpierw aktywowane z ograniczoną proteolizą przy użyciu trypsyny. Użyliśmy trypsyny do aktywacji X-FL zamiast Lys-C do testów funkcjonalnych, ponieważ trypsyna pozwala nam zatrzymać proteolizę przy użyciu inhibitorów trypsyny. Aktywowany X-FL wnikał do hodowlanych neuronów korowych szczura i rozszczepiał zarówno VAMP2, jak i VAMP4 w sposób zależny od stężenia (ryc. 4e). Kombinacje surowic przeciw znanym BoNT (Ab1 (surowica końska): trójwartościowa anty-BoNT/A, B i E, anty-BoNT/C i anty-BoNT/F; Ab2 (surowica kozia): anty-BoNT/G i anty-BoNT/D) nie miały wpływu na aktywność podwiązanego X-FL, o czym świadczy podobny stopień rozszczepienia VAMP2 i VAMP4 w obecności tych surowic (ryc. 4e). Wyniki te potwierdziły, że BoNT/X jest nowym serotypem BoNT.

BoNT/X wywołuje porażenie wiotkie in vivo u myszy

Następnie staraliśmy się określić, czy BoNT/X jest aktywny in vivo przy użyciu dobrze znanego, nieśmiertelnego testu u myszy, znanego jako test Digit Abduction Score (DAS), który mierzy lokalny paraliż mięśni po wstrzyknięciu BoNT do mięśni tylnych kończyn myszy44. BoNTs powodują wiotki paraliż mięśni kończyn, który objawia się niemożnością rozstawienia palców w odpowiedzi na bodziec startowy. Wstrzyknęliśmy podwiązany X-FL (0,5 μg, aktywowany przez trypsynę) do mięśni brzuchatych prawej tylnej kończyny u myszy, co wywołało typowy wiotki paraliż i niemożność rozstawienia palców (ryc. 4f), wskazując, że BoNT/X jest zdolny do wywoływania wiotkiego paraliżu in vivo. Zwracamy uwagę, że siła działania podwiązanego X-FL wydaje się być znacznie niższa niż innych BoNT w tym teście. Aby dodatkowo potwierdzić niską toksyczność podwiązanego X-FL, wstrzyknęliśmy myszom 1 μg podwiązanego X-FL dootrzewnowo (n=3). Żadna z myszy nie wykazała efektów ogólnoustrojowych i wszystkie przeżyły przy tej dawce. Tak więc, podwiązany X-FL ma raczej niską toksyczność in vivo u myszy w porównaniu z innymi natywnymi BoNT, które zwykle mają dawki śmiertelne na niskim poziomie pikogramów na mysz.

Nieaktywny BoNT/X

Na koniec, opracowaliśmy nieaktywny mutant BoNT/X jako potencjalny odczynnik do generowania przeciwciał neutralizujących. Mutacje w dwóch resztach (R362A/Y365F) w BoNT/A inaktywują aktywność proteazową LC i znoszą toksyczność BoNT/A in vivo45,46. Te dwie reszty są konserwowane w BoNT/X. Wprowadziliśmy odpowiednie mutacje (R360A/Y363F) do BoNT/X i wygenerowaliśmy nieaktywną formę o pełnej długości, oznaczoną jako BoNT/XRY. Jak pokazano na Rys. 4g, BoNT/XRY został oczyszczony jako białko znakowane His6 w E. coli i nie wykazywał aktywności na hodowanych neuronach (Dodatkowa Figura 8a). Ponadto, dootrzewnowe wstrzyknięcie myszom 30 μg BoNT/XRY (aktywowanego przez trypsynę) nie spowodowało żadnych działań niepożądanych (n=5), co dowodzi, że nie jest on toksyczny in vivo. Znaczna część BoNT/XRY tworzyła agregaty na szczycie żelu SDS-PAGE (Rys. 4g). Dodanie DTT zredukowało te agregaty do monomerycznego BoNT/XRY (ryc. 4g). Tak więc, pełnometrażowy BoNT/X jest podatny na tworzenie międzycząsteczkowych wiązań disulfidowych. Niemniej jednak, monomeryczna forma BoNT/X może być oczyszczona i jest stabilna w roztworze (Rys. 4g). Ponadto, opracowaliśmy protokół oczyszczania w skali, który pozwolił na uzyskanie BoNT/XRY z wydajnością ∼ 3 mg na litr hodowli i czystością ∼90% (Supplementary Fig. 8b). Wysoce oczyszczony BoNT/XRY pozostawał stabilny w roztworze do 10 mg ml-1 w obecności czynnika redukującego. Ten atoksyczny BoNT/XRY będzie cennym odczynnikiem do generowania przeciwciał neutralizujących.

.