Guanidine

Membrane Proteins

Guanidine i roztwory SDS są rozpuszczalnikami denaturującymi, ale chcieliśmy, oczywiście, scharakteryzować również stany natywne białek membranowych. Trudność polegała na tym, że nie było jeszcze konsensusu co do tego, jak definiować lub pojmować stan natywny – co dla nowicjuszy, takich jak my, przekładało się na niepewność, ponieważ nie mieliśmy takiego doświadczenia, które pozwoliłoby nam na sprytne odgadnięcie, który z kłócących się pomysłów prawdopodobnie okaże się poprawny.

Nawet warstwy fosfolipidowej, jeden niezbędny koncept dla najbardziej minimalnego zrozumienia błon komórkowych, wciąż był kwestionowany, pomimo faktu, że po raz pierwszy wykazano w czerwonych krwinek prawie 50 lat wcześniej i że był to naprawdę jedyny możliwy układ na podstawie termodynamiki, bezpośrednią konsekwencją klasycznych pomiarów 1917 Irving Langmuir z monowarstwami substancji amfifilowych. Opisałem niedorzecznie powolną akceptację koncepcji dwuwarstwowej w międzyczasie w mojej książce Ben Franklin Stilled the Waves . Punkt tutaj jest, że sceptycyzm nadal utrzymywał się, kiedy zaangażowaliśmy się w badania membran.

A wśród tych, którzy byli przekonani o dwuwarstwie lipidowej, sposób włączenia białek w membrany był nadal otwarty do debaty. Niektórzy, jak nasz kolega z Duke David Robertson, byli niechętni, aby uwierzyć, że białka mogą rzeczywiście przeniknąć lub przejść przez warstwę. Dwa dość rozbieżne koncepcyjne obrazy, zaczerpnięte z konferencji w Nowojorskiej Akademii Nauk w 1972 roku, pokazane są na Rysunku 3. Jeden to „membrana jednostkowa” Robertsona z białkiem całkowicie na zewnątrz. Drugi przedstawia pogląd Vanderkooi na kompleksy oksydazy cytochromowej w błonach mitochondrialnych: białko jest umiejscowione bardziej realistycznie, ale nie ma jeszcze koncepcji odrębnych domen hydrofilowych i hydrofobowych i tego, jak mogą one dyktować interakcję białko-lipid. Później w tym samym 1972 roku, obecnie konwencjonalny wyidealizowany obraz dwuwarstw fosfolipidowych, z funkcjonującymi białkami biegnącymi przez całą drogę przez nie, został ostatecznie spopularyzowany przez model „płynnej mozaiki” Singera i Nicolsona .

Rys. 3. Dwa rozbieżne koncepcyjne obrazy białek błonowych, oba zaproponowane na tym samym spotkaniu w Nowym Jorku w 1972 roku: (a) Robertson myślał, że białka będą asymetrycznie rozmieszczone, na zewnątrz dwóch powierzchni dwuwarstwowych; (b) widok Vanderkooi kompleksów oksydazy cytochromowej w przekroju.

W laboratorium były to ekscytujące czasy, najbardziej ekscytujące, jakie pamiętam. Dowiedzieliśmy się, jak korzystać z łagodnych detergentów, które, w przeciwieństwie do SDS, mogą solubilizować białka membranowe bez denaturacji brutto, w środowisku symulującym stan natywny, ale środowisko, w którym będą one również łatwo dostępne do charakterystyki molekularnej – postęp, w którym byliśmy w części przewidziane przez dwóch sympatycznych młodych mężczyzn z Finlandii, Kai Simons i Ari Helenius .

W praktyce nadal byliśmy głównie ograniczeni do pomiaru masy cząsteczkowej i pytając, jak wiele łańcuchów polipeptydowych na cząsteczkę, ale białka, do których te pytania były skierowane zostały oddzielone przez detergent leczenia od innych składników błony. Co najważniejsze, wiele z tych białek miało znane funkcje komórkowe i nasze pomiary były istotne dla tych funkcji. Wspomniałem już o czerwonych krwinkach, ale w rzeczywistości udało nam się objąć szereg biologicznie istotnych tematów, pobudzonych w wielu przypadkach przez misjonarski zapał studentów. Na przykład student fizjologii, Stuart Grefrath, zainteresowany neurofizjologią, przybył do naszego laboratorium, aby wyliczyć łańcuchy polipeptydowe pobudliwej błony – w tym przypadku pochodzącej z nerwu węchowego garfona – i to doprowadziło nas do późniejszego zaangażowania w kilka innych aktywnych systemów transportowych. (Sam Stuart niestety zmarł w wyniku wrodzonej choroby układu krążenia, zanim mógł spełnić swoją wczesną obietnicę niezależnej kariery). Mózgowa mielina była kolejną błoną układu nerwowego, której się przyjrzeliśmy.

Warto również wyróżnić dwóch gości laboratorium, którzy zdecydowali się pracować razem: Neal Robinson, postdoctoral fellow, i Leon Visser, który był na urlopie naukowym z CSIR w Pretorii, Republika Południowej Afryki). Zrobili bardzo schludną pracę ilościowego określenia struktury domeny cytochromu b5, rodzaj prototypu dla ilustracji, jak białka błonowe są dołączone do błon i nadal wykonywać swoje funkcje w sąsiedniej cytoplazmie .

W innych projektach byliśmy odpowiadając na wnioski od odległych kolegów. Wspomniałem już pracę z Arturem Karlinem nad receptorem acetylocholinowym z ryby elektrycznej. Innym przykładem była bakteriorhodopsina, dla której wykonaliśmy pomiary w roztworze detergentu na prośbę Waltera Stoeckeniusa z Uniwersytetu Kalifornijskiego. Pojawiło się tu ważne pytanie, zwi±zane z mechanizmem pompowania protonów przez to białko: czy natywne białko jest funkcjonalnie monomerem, czy też (jak zdawały się sugerować niektóre dane) trimerem? Nasze rozpuszczone białko było bezsprzecznie monomerem, a dowody spektralne wskazywały, że przechodziło ono ten sam cykl zmian molekularnych, co w natywnej błonie.

W większości przypadków sami nie angażowaliśmy się bezpośrednio w próby rozwikłania tego, jak działały receptory, pompy czy kanały, ale nieuchronnie stawaliśmy się świadomi tego, na czym polegały problemy. Było to naprawdę wzbogacające doświadczenie, zupełnie odmienne od czasów, gdy albumina surowicy i β-laktoglobulina (otrzymywane od dostawców komercyjnych) były głównymi celami naszych badań.

W przypadku pomp jonowych rzeczywiście zajmowaliśmy się fizjologią, głównie na poziomie hipotez lub teorii; nauczyliśmy się modelować schematy kinetyczne za pomocą komputera; uczestniczyliśmy w odpowiednich konferencjach itd. Ważny pod tym względem był nasz ostatni urlop naukowy – do Instytutu Maxa Plancka w Heidelbergu. Przewodniczący wydziału fizjologii w Duke, Ted Johnson, dołączył do nas przy tej okazji, więc było nas trzech w aktywnej współpracy. Ted od dawna był entuzjastą komputerów i podłączył każdego członka wydziału fizjologii do centralnego ośrodka komputerowego w North Carolina Research Triangle, zanim jeszcze modne stało się wydawanie w ten sposób funduszy wydziałowych. W tamtych czasach musieliśmy pisać własne programy na komputer, co było dla mnie trudne, ale wierzę, że uzyskaliśmy kilka użytecznych wyników, głównie w zakresie modeli kinetycznych dla cyklu pompowania ATP napędzanego przez pompę Na,K. Pracowaliśmy w niekonwencjonalnych godzinach, także w weekendy i święta, co czasem wprawiało w zakłopotanie naszych gospodarzy z Heidelbergu, którzy mieli w zwyczaju wyłączać centralne ogrzewanie, gdy laboratorium miało być niezamieszkane. Mniej więcej co dziesięć dni jeździliśmy przez granicę do Strasburga na wykwintny lunch – w towarzystwie alzackich win, których smakiem cieszymy się do dziś.