Gamma-Glutamyl Transpeptidase

Activity and Specificity

Reakcja katalizowana przez ten enzym jest więc ogólnie rozumiana jako przeniesienie grupy γ-glutamylowej na różne cząsteczki akceptorowe, takie jak woda, aminokwasy, dipeptydy i sam donor γ-glutamylu, w zależności od warunków reakcji. Te właściwości katalityczne są związane z mechanizmem katalitycznym GGT, w którym reakcja przebiega w mechanizmie podwójnego przesunięcia acylacyjno-deacylacyjnego za pośrednictwem intermediatu γ-glutamylo-enzymu.

Jak można się spodziewać na podstawie struktur naturalnego substratu – glutationu i jego pochodnych, GGT ściśle rozpoznaje cząsteczkę γ-glutamylową, ale ma dość szeroką specyficzność substratową w odniesieniu do grupy opuszczającej (Xaa). Glutation, jego S-konjugaty, disiarczek glutationu, di- lub tripeptydy γ-glutamylowe, glutamina, l-α-metylowe pochodne amidów γ-glutamylowych, leukotrien C4, pochodne poli-γ-glutamylowe są akceptowane jako substraty. Sztuczne substraty takie jak l-γ-glutamylo-p-nitroanilid (l-γ-Glu-pNA) i fluorescencyjna l-γ-glutamylo-7-amino-4-metylokumaryna (l-γ-Glu-AMC) są aktywnymi substratami powszechnie stosowanymi w obecności lub nieobecności akceptorów γ-glutamylu (patrz poniżej) do oznaczania odpowiednio transpeptydazy lub hydrolazy.

Swoistość substratu w odniesieniu do akceptora jest najszerzej badana w przypadku GGT z nerek szczura. Izomery l obojętnych aminokwasów, takie jak l-cystyna, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys i l-Ser są dobrymi akceptorami, ale hydrofobowe i rozgałęzione aminokwasy, takie jak l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile i l-Val są raczej słabymi substratami. d-Aminokwasy i α-podstawione aminokwasy nie działają jako substraty akceptora. Dlatego użycie d-γ-Glu-pNA jest dogodnym sposobem tłumienia autotranspeptydacji w pomiarach aktywności hydrolaz. Ponieważ miejsce wiążące akceptor pokrywa się z miejscami dla cząsteczki Cys-Gly glutationu, enzym preferuje dipeptydy z Gly na C-końcu, takie jak l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly i l-Ser-Gly jako substraty akceptorowe w porządku malejącym względnej aktywności. Peptydy o więcej niż dwóch resztach aminokwasowych są bardzo słabymi akceptorami. Wartości Km dla aminokwasów akceptorowych i dipeptydów są stosunkowo wysokie, mieszczą się w zakresie od 0,1 do 5 mM , ale Gly-Gly (Km=3 mM) jest najwygodniej stosować jako substrat akceptorowy dla aktywności transpeptydaz. Wysokie stężenia cząsteczek akceptora hamują GGT kompetycyjnie w stosunku do donora γ-glutamylu (γ-Glu-Xaa), prawdopodobnie z powodu nakładania się miejsca wiążącego dla Xaa i miejsca wiążącego dla akceptora. Specyficzność substratu w stosunku do podstrefy Cys zależy od pochodzenia enzymu; na przykład enzym E. coli preferuje w tym miejscu aminokwasy zasadowe (l-Arg, l-Lys i l-His) i aromatyczne (l-Phe, l-Trp i l-DOPA). Należy jednak uważać na specyficzność akceptora, ponieważ pozorna aktywność zależy również od efektywnego stężenia zdeprotonowanego aminokwasu dostępnego w danym pH. Stosunkowo wysoka aktywność obserwowana w przypadku Gly-Gly wynika po części z niskiego pKa tego dipeptydu. Deprotonowane grupy aminowe substratów akceptorowych wydają się być niezbędne do transpeptydacji.

Najpowszechniej stosowanym substratem donorowym do oznaczeń enzymatycznych jest l-γ-Glu-pNA. Typowa mieszanina do oznaczania aktywności transpeptydazowej enzymu nerki szczura składa się z 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly w 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) w temperaturze 25°C. Dodanie odpowiedniego stężenia Gly-Gly skutecznie hamuje hydrolizę i autotranspeptydację. Optymalne pH GGT wynosi około 7,5-9 dla transpeptydyzacji, ale zależność pH jest znacznie mniejsza dla hydrolizy. Jest to zgodne z faktem, że pozorna aktywność transpeptydazy zależy, częściowo, od efektywnego stężenia wolnej grupy aminowej akceptorów .

Aktywność hydrolazy dla glutaminy jest zwiększona do 12-krotnie przez dodanie modulatorów ukierunkowanych na miejsce akceptora, takich jak maleinian, hippuran i glikocholan. Dodatek tych związków hamuje wiązanie substratów akceptorowych i donorów γ-glutamylu, które zajmują miejsca Cys-Gly. Dodanie donorów γ-glutamylu lub związanie inhibitorów w miejscu donora γ-glutamylu zwiększa powinowactwo tych modulatorów, wskazując na kooperatywne oddziaływania pomiędzy miejscami wiązania donorów γ-glutamylu i akceptorów (przegląd patrz Tate & Meister ). Sugeruje się, że miejsce akceptorowe zajmowane przez te modulatory promuje zmianę konformacyjną GGT w formę aktywną, ułatwiając w ten sposób tworzenie stanu przejściowego. Proponuje się również, aby wyjaśnić wzrost szybkości inaktywacji enzymów ssaków przez acivicin (vide infra), ale nie zaobserwowano tego przy hamowaniu przez γ-monofluorofosfonian, etykieta powinowactwa skierowana do miejsca aktywnego analogu stanu przejściowego . Wydaje się, że acivicin wiąże się z resztami nukleofilowymi innymi niż katalityczny nukleofil ssaków GGT .

GT jest odwracalnie i konkurencyjnie hamowany przez l- i d-γ-glutamylo-(o-karboksy)fenylohydrazyd (antglutynę, wytwarzaną przez Penicillium oxalicum) z Ki wynoszącym 8 μM, i nie zgłasza się ostrej toksyczności dla myszy . Kilka analogów glutaminianu z grupą reaktywną w pobliżu γ-karboksy działają jako nieodwracalne inhibitory. 6-diazo-5-okso-l-norleucyna (DON), O-diazoacetylo-l-seryna (l-azaseryna) i kwas l-(αS,5S)-α-amino-3-chloro-4,5-dihydro-5-izoksazolooctowy (acivicyna lub AT-125, wytwarzane przez Streptomyces sviceus) są silnymi, ale niespecyficznymi inaktywatorami GGT. Acivicin był szeroko stosowany do tłumienia aktywności GGT in vivo, chociaż acivicin jest wysoce toksyczny poprzez inaktywację szeregu amidotransferaz glutaminowych biorących udział w biosyntezie nukleotydów, aminokwasów i aminocukrów. Kompleks serynowo-boranowy wiąże się odwracalnie z miejscem wiązania γ-glutamylu i hamuje GGT z Ki wynoszącym 20 μM. To klasyczne odkrycie doprowadziło do powstania silnego i wolno wiążącego się inhibitora, kwasu l-2-amino-3-boronobutanowego (γ-boroGlu). GGT jest hamowany z całkowitym Ki wynoszącym 17 lub 35 nM, ale inhibicja jest wciąż odwracalna. Kwas 2-amino-4-(fluorofosfono)butanowy (γ-PFGlu), analog glutaminianu z elektrofilowym fosforem zastępującym γ-karboksyl, jest silnym, opartym na mechanizmie i ukierunkowanym na miejsce aktywne czynnikiem znakującym powinowactwo do E. coli GGT. Związek ten szybko i nieodwracalnie hamuje GGT tworząc stabilny, anionowy i tetraedryczny addukt przejściowo-podobny, który może być wykorzystany do mapowania peptydowego w celu identyfikacji katalitycznego nukleofila E. coli GGT (vide infra). Seria γ-(monofenylo)fosfono- i γ-fosfonodiestrowych analogów glutaminianu służy jako inhibitory oparte na mechanizmie, które nieodwracalnie hamują GGT poprzez kowalencyjną modyfikację jego katalitycznego nukleofila. W szczególności, γ-fosfonodiestry, które zawierają strukturalną mimikę Cys-Gly i jej C-końcową grupę karboksylową wykazują wyjątkowo wysoką aktywność wobec ludzkiego GGT, szybkość inaktywacji jest od 130 do 6000 razy większa niż acivicyny. Inhibicja jest selektywna dla GGT i nie obserwuje się toksyczności. Jeden z tych inhibitorów jest dostępny w handlu pod nazwą „GGsTop” (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Nieglutaminianowy analog inhibitora ludzkiej GGT został znaleziony przez high-throughput screening . Związek ten zajmuje miejsce akceptorowe kompleksu z substratem γ-glutamylowym z Ki wynoszącym 17,6 μM. Inhibitor jest selektywny gatunkowo, ale jest odwracalny i odnotowano pewną toksyczność.

Reakcja katalizowana przez GGT jest uważana za przebiegającą w mechanizmie ping-pongowym poprzez intermediat γ-glutamylo-enzymu, jak zaobserwowano w przypadku hydrolaz serynowych. N-końcowy Thr Oγ w małej podjednostce jest katalitycznym nukleofilem, do którego przyłączona jest grupa γ-glutamylowa (patrz Chemia Strukturalna). Katalityczny nukleofil GGT został zidentyfikowany po raz pierwszy w przypadku E. coli GGT jako N-końcowa reszta Thr (Thr391) w małej podjednostce poprzez mapowanie peptydowe enzymu inaktywowanego γ-PFGlu . Reszta ta, odpowiadająca Thr380 (enzym z nerki szczura) i Thr381 (enzym ludzki), jest konserwowana wśród wszystkich GGT, których sekwencje pierwotne są znane. Katalityczny nukleofil ludzkiego GGT został zidentyfikowany jako Thr381 poprzez mapowanie peptydowe enzymu inaktywowanego przez etykietę powinowactwa γ-(monofenylo)fosfonowego. Zatem reakcja katalizowana przez GGT rozpoczyna się od ataku nukleofilowego N-końcowej reszty Thr w małej podjednostce na γ-karboksy substratu donorowego (γ-Glu-Xaa) w celu eliminacji Xaa. Utworzony w ten sposób enzym γ-glutamylowy reaguje z wodą (hydroliza) lub z aminokwasami i dipeptydami (transpeptydacja i autotranspeptydacja) w etapie determinującym tempo.

GT jest członkiem N-końcowych hydrolaz nukleofilowych (Ntn-hydrolazy), jak przewidziano na podstawie jego unikalnego fałdu i procesu dojrzewania, w którym aktywna dimeryczna forma dojrzałego enzymu jest generowana przez potranslacyjne autokatalityczne przetwarzanie katalitycznie nieaktywnego prekursora. Zostało to potwierdzone przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce oraz rentgenowską analizę strukturalną enzymów bakteryjnych (patrz Chemia Strukturalna).