— FRAPcms

FRAP jest metodą mikroskopii fluorescencyjnej służącą do badania mobilności fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w żywych komórkach. Stosuje się ją do analizy dyfuzji cząsteczek w komórce, płynności błon biologicznych i wiązania białek.

Zasada:

FRAP może być przeprowadzony przy użyciu nowoczesnego mikroskopu konfokalnego. Wymaga fluorescencyjnego znakowania cząsteczki zainteresowania, na przykład przez przeciwciało znakowane GFP. Typowy eksperyment FRAP obejmuje trzy odrębne fazy. Po pierwsze, mierzona jest początkowa fluorescencja w obszarze zainteresowania. Następnie, cząsteczki fluorescencyjne są fotobielone w wybranym obszarze. Odbywa się to poprzez skupienie wiązki laserowej na odpowiednim obszarze, co prowadzi do intensywnego oświetlenia i wygaszenia fluoroforów. W rezultacie można zaobserwować ciemny obszar w skądinąd fluoryzującej próbce. W końcu, fluorescencyjne cząsteczki z otoczenia mogą dyfundować przez próbkę i wymieniać fotobielone cząsteczki na nieuszkodzone. Ten powrót fluorescencji jest mierzony w czasie.

Ponieważ wiele czynników może wpływać na kinetykę powrotu fluorescencji, eksperymenty FRAP muszą być dobrze zaplanowane, a uzyskane dane dokładnie przeanalizowane. Wówczas możliwe jest uzyskanie współczynnika dyfuzji i parametrów ruchliwości molekuł za pomocą modelowania matematycznego.